血栓性疾病是严重危害人类健康的疾病之一，而利用溶栓剂治疗血栓病的溶栓疗法被认为是最为有效的方法。据统计，全世界每年有血栓栓塞性病人约1700万，所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。因此，寻找和研制新型、高效、安全的溶栓药物并实现高效高活性表达，对于更有效地治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。 Fibrolase是来自美国铜头蝮蛇毒的一种锌金属蛋白酶，具有纤溶活性而无出血活性。Alfimeprase(ALF)是Fibrolase的N端突变体体(前3个氨基酸EQR曲Ser取代)，与Fibrolase具有同样的溶栓功能，由美国Nuveo公司研制开发并申请了专利，其Ⅰ期关于治疗慢性周围动脉血栓(PAO)和Ⅱ期关于治疗周围静脉导管栓塞病(CVAD)的临床试验结果显示，ALF不仅是一种直接快速呈剂量相关的溶栓剂，而且很有希望成为第一个快速、高效、安全的蛇毒基因工程溶栓药物，现已开始用于治疗急性PAO和CVAD的Ⅲ期临床试验。 由于毕赤酵母(P. pastoris)表达系统是目前较完善的高效异源蛋白表达系统，具有高分泌表达、高稳定整合、易于高密度发酵和产物的下游纯化等优点，所以本研究采用该系统对ALF的高效高活性表达进行了研究。研究通过双酶切从构建好的克隆载体p43-alf上获取目的基因his6-alf,将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K和pPICZα A，经高效电转化、筛选鉴定、甲醇诱导表达获得了重组ALF(rALF)高表达菌株GS115/pPIC9K-his6-alf,KM71/pPIC9K-his6-alf和GS115/pPICZα A-his6-alf. SDS-PAGE和Western blotting分析表明rALF的分子量约为23.8 kDa，且能与小鼠抗His·tag的单克隆抗体特异结合，这说明rALF获得了特异表达。通过对培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和诱导时间的优化，三种重组菌中rALF的表达量分别高达510 mg/L、465 mg/L和425 mg/L。同时可见pPIC9K-his6-alf组菌中KM71重组菌比GS115重组菌表达的rALF更纯，而GS115重组菌单位体积表达液中rALF的表达量更大。三种重组菌的优化表达液经His·bina柱纯化后，rALF纯度分别高达94.8％、96％禾1195％。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果表明rALF获得了高活性分泌表达，且其纤溶活力呈现出剂量相关性和时间依赖性。另外，rALF的电泳检测和混合纤溶活性测定分析结果显示：对于rALF的高效高活性分泌表达而言，pPIC9K载体相对较优越于pPICZα A载体，而GS115和KM71菌株之间的优越性并无明显差别。结论：研究通过系列操作确立了一种高效高活性优化表达体系，为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。