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干扰素(Interferon,IFN)是一种由细胞分泌的一族活性糖蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的作用。IFN-γ可以提高MHCⅠ和MHCⅡ分子的表达,促进CD8+T细胞、CD4+T细胞的形成和反应;还可以调节B细胞的发育、增殖和抗体分泌。猪IFN-γ在抗病毒和增强疫苗免疫力方面具有良好的应用前景,有望成为新一代的疫苗佐剂。为了开发猪IFN-γ用于疫苗佐剂,我们进行了猪IFN-γ的基因克隆、酵母表达及其应用的研究。
本研究应用RT-PCR技术从猪血液中扩增出猪IFN-γ基因片段,并将其克隆到TOPO-PCR载体中,构建了含猪IFN-γ基因的克隆载体TOPO-IFN-γ。用EcoR,Ⅰ和XbaⅠ对其进行双酶切,将回收IFN-γ基因片段重组到酵母表达载体,构建了含猪IFN-γ基因的重组质粒pPICZ-IFN-γ。对pPICZ-IFN-γ,进行双酶切,其酶切片段大小为400-500bp。对pPICZ-IFN-γ进行测序,目的片段的基因序列与GenBank中的猪IFN-γ相同。采用电击法将重组表达质粒pPICZ-IFN-γ导入到巴斯德毕赤酵母内,酵母培养液经SDS-PAGE和Westen-blot检测,在蛋白分子量约为18 kDa处有2条能与兔抗猪IFN-γ抗体起特异性反应的条带。经猪肾传代细胞(PK-15)-VSV检测系统测定,重组猪IFN-γ酵母表达物(rPoIFN-γ)能有效地抑制VSV在PK-15细胞上产生病变,其效价最高达3.84×104U/mL。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reroproductive andRespiratorySyndrome,PRRS)、猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)和伪狂犬病(Pseudorabies,PR)对养猪业危害极大,但疫苗免疫效果往往不理想,为了提高这三个病的疫苗免疫效果,分别进行了rPoIFN-γ对PRRS、CSF和PR疫苗免疫抗体水平影响的研究。rPoIFN-γ对PRRS弱毒疫苗的作用效果:现场选取广东博罗某200多头母猪猪场70d PRRS抗体阴性猪9头,将其分为3组,每组3头,分别接种PRRS弱毒疫苗,同时对其中2组猪再分别注射2500U和5000U rPoIFN-γ。结果显示,接种4w后,PRRS疫苗+5000U rPoIFN-γ组猪的PRRS抗体S/P值为0.397,比单独注射PRRS疫苗组猪的抗体S/P值(0.037)有显著的升高(P＜0.01);PRRS疫苗+2500U rPoIFN-γ组猪的抗体S/P值为0.094,与PRRS疫苗组差异不显著(P＞0.05)。rPoIFN-γ对PRRS灭活疫苗的作用效果:现场选取广东东莞某600多头母猪猪场的10d抗体阳性仔猪20头,将其分为4组,每组5头,首次分别接种PRRS灭活疫苗+5000U rPoIFN-γ、PRRS灭活疫苗+2500U rPoIFN-γ、PRRS灭活疫苗+1250U rPoIFN-γ和PRRS灭活疫苗。第4w后再进行第二次追加接种,接种方式同第一次。结果显示,PRRS灭活疫苗+5000U rPoIFN-γ组猪的PRRS抗体S/P值第一次接种2w后即显著升高,第二次接种后继续升高,与疫苗对照组的抗体水平有显著差异(P＜0.01);其他3组猪的PRRS抗体S/P值在第二次接种2w后才明显升高,PRRS灭活疫苗+rPoIFN-γ组猪的抗体S/P值要比疫苗对照组高,但无显著差异(P＞0.05)。
rPoIFN-γ对CSF弱毒疫苗免疫的影响:现场选取广东海丰某400多头母猪猪场30d仔猪4窝,将其分为4组,各组仔猪分别接种CSF疫苗+5000U rPoIFN-γ(9头)、CSF疫苗+2500U rPoIFN-γ(10头)、CSF疫苗+酵母上清(8头)及空白对照组(7头)。结果显示,接种4w后,CSF疫苗+5000U rPoIFN-γ与CSF疫苗+2500U rPoIFN-γ组猪的抗体阻断率分别为49.33和51.7,比疫苗对照组(23.1)有显著的提高(P＜0.01),空白对照组仅为13.4。rPoIFN-γ对接种二次CSF弱毒疫苗的影响:现场选取东莞某场24d仔猪20头,将其分为4个组,各组5头,每组首次分别接种CSF疫苗+5000U rPoIFN-γ、CSF疫苗+2500U rPoIFN-γ、CSF疫苗+1250U rPoIFN-γ和CSF疫苗。首次接种6w后,再按如上分组方式进行第二次接种。结果显示,自第一次接种至第6w,各组猪的CSF抗体水平在不断的下降,CSF疫苗+rPoIFN-γ组猪的抗体水平下降比疫苗对照组慢,但它们之间没有显著差异(P＞0.05)。第二次接种后,各组猪的CSF抗体水平开始上升,CSF疫苗+rPoIFN-γ组猪的抗体水平上升要快些。rPoIFN-γ剂量越高,疫苗抗体上升的效果越好。特别是CSF疫苗+5000U rPoIFN-γ组抗体升高比其他组显著(P＜0.01)。
rPoIFN-γ对PR-gE缺失疫苗免疫的影响:现场选取广东增城某300多头母猪猪场40d抗体阴性仔猪15头,将15头仔猪分为3组4头和1组3头,每组分别接种PR疫苗+1000U rPoIFN-γ、PR疫苗+100U rPoIFN-γ、PR疫苗+10U rPoIFN-γ(3头)和PR疫苗。结果显示,接种2w后,PR+1000U rPoIFN-γ组和PR+100U rPoIFN-γ组猪的PR-gB抗体S/N值分别为0.078和0.08,明显低于PR疫苗组0.21,差异显著(P＜0.01);PR+10U rPoIFN-γ组为0.24,与疫苗对照组差别不大(P＞0.05)。rPoIFN-γ对PR抗体阳性猪接种PR-gE缺失疫苗抗体水平的影响:现场选取东莞某场20头52d仔猪,将其分为4组,每组5头,各组分别接种PR疫苗+5000U rPoIFN-γ、PR疫苗+2500U rPoIFN-γ、PR疫苗+1250U rPoIFN-γ和PR疫苗。结果显示,自接种后至第5w,各组猪的PR-gB抗体水平有所下降,PR疫苗+5000U rPoIFN-γ组猪的抗体水平下降缓慢,基本保持原有抗体水平,与疫苗对照组差异显著(P＜0.01);PR疫苗+2500U rPoIFN-γ和PR疫苗+1250U rPoIFN-γ组猪的抗体水平下降比疫苗对照组要慢,但差异不显著(P＞0.05)。结果证明rPoIFN-γ有延缓PR抗体下降的作用。
本研究成功从猪外周血中扩增出猪IFN-γ基因片段并将其克隆到pPICZαA中,构建了含猪IFN-γ基因的重组质粒pPICZ-IFN-γ。将猪IFN-γ基因重组到巴斯德毕赤酵母内,重组酵母经甲醇诱导产生rPoIFN-γ,经PK-15-VSV检测系统测定,rPoIFN-γ,能有效地抑制VSV在PK-15细胞上增殖。应用猪IFN-γ酵母表达物对PRRS、CSF和PR疫苗的免疫影响结果表明,在母源抗体阴性的状况下,同时接种疫苗和rPoIFN-γ,能明显提高3种疫苗抗体水平;在母源抗体较高的状况下,同时接种疫苗和rPoIFN-γ,各疫苗的抗体水平有所下降,但是疫苗加rPoIFN-γ组抗体下降速度比单独疫苗组要慢。本研究获得的rPoIFN-γ增强疫苗抗体水平的结果表明其有较好的实用价值和潜在的应用前景。