破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor，ODF)是近年来新发现的重要的骨代谢调节因子，它已经成为代谢性骨病领域的研究热点。ODF作用复杂，无论在正常的生理状态下，还是在异常的病理状态下，其效应实现的途径，效应的调节等机制尚未完全阐明。用基因工程制备大量的ODF，可以为进一步的研究提供物质基础。 本研究选择了具有功能活性的人ODF可溶片段(aa 145-317)cDNA，分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行了克隆表达。大肠杆菌表达系统操作简便，能够快速获得蛋白，可制备相应的抗体。哺乳动物细胞表达的蛋白有优良活性，可以满足功能研究的需要。 在大肠杆菌表达系统中，PCR扩增人ODF可溶片段cDNA，然后将扩增片段插入到原核表达载体pET42a的多克隆位点——PshA Ⅰ酶切位点处，构建为重组融合表达载体pET42a／ODF。经酶切和测序鉴定后，重组融合表达载体转化E．Coli BL21(DE3)进行表达。超声裂解细菌，SDS-PAGE鉴定裂解物中是否含有重组融合ODF蛋白。Western Blot鉴定融合蛋白是否具有免疫原性。 在哺乳动物细胞表达系统中，为提高蛋白表达量，避免外源蛋白对细胞的毒性，构建了分泌型表达载体pcDNA／asODF-GFP。PCR扩增人ODF可溶片段cDNA时，在上游引物5’端引入了一段翻译增强序列和一段分泌信号序列。经修饰扩增后的ODF cDNA片段与真核表达载体pcDNA3.1／CT-GFP-TOPO连接，构建为重组分泌表达载体。 为利用二氢叶酸还原酶基因(dhfr)作为筛选、扩增标记来提高目的基因的表达量，本研究还构建了dhfr重组表达载体pcDNA／DHFR-GFP。PCR分别扩增弱化的SV40早期基因启动子序列、小鼠二氢叶酸还原酶cDNA序列、SV40polyA信号序列，然后利用引物中设计的互补碱基配对，经PCR重叠延伸扩增，将三硕士研究生学位论文不开履运履属.兰不夏颧礁潺l录功能丽-丽下翁醉玩开面又乘蔽海丽peDNA3.l/CT一GFP的Sspl酶切位点。 将ODF重组表达载体和DHFR重组表达载体共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(c HO一dhfr一)，观察报告基因(GFP)的绿色荧光确定转染是否成功。以不含次黄嗓吟(H)、胸腺啥睫脱氧核昔(T)的培养液培养筛选，氨甲蝶吟(MTX)梯度加压扩增，有限稀释法克隆，得到稳定转染的阳性细胞。提取细胞总RNA和基因组DNA进行RT一PcR和PCR鉴定目的基因的整合及转录。 本试验在大肠杆菌中成功克隆表达了人ODF可溶片段cDNA，表达蛋白具免疫原性，为制备人ODF抗体奠定了基础。成功构建了人ODF的哺乳动物细胞分泌表达载体和含有扩增标记基因的表达载体，并成功转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞。实验目前正在进行高表达细胞株的筛选及表达蛋白的检测等工作。