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目的和意义CD25表达于活化T细胞表面,静息T细胞不表达,这为靶向治疗以活化T细胞介导的疾病如T细胞淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥反应等提供了科学依据。采用毕赤酵母表达系统,以Daclizumab(人源化抗CD25单抗隆抗体)为基础,构建重组表达载体pPICZalpha A-biscfv (Daclizumab)和pPICZalpha A-dmDT390-biscfv (Daclizumab),在重组毕赤酵母GS115菌株中诱导表达biscfv (Daclizumab)和dmDT390-biscfv (Daclizumab)重组蛋白,为淋巴瘤、急性排斥反应、自身免疫病等疾病提供新的药物治疗方案。研究方法合成目的基因及构建表达载体：利用DNAWorks软件,获得具有互补末端的寡核苷酸引物,采用装配PCR法,合成四条短的基因片段scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)、 dmDT390并连接至pMD19-T载体,测序正确后,四条短的基因片段酶切拼接后最终连入毕赤酵母表达载体pPICZalpha A。采用毕赤酵母系统表达蛋白：线性化的表达载体通过氯化锂转化方法转至毕赤酵母GS1 15,在含有博来霉素的YPDS平板中筛选阳性克隆子。采用BMGY培养基增殖培养,BMMY培养基诱导蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot:蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上,采用鼠抗组氨酸尾抗体作为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗,采用化学发光试剂盒观察结果。蛋白纯化：采用镍柱纯化蛋白,纯化出的蛋白采用高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。结果1.通过DNAWorks软件设计出合成scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)的24条寡核苷酸引物,以及合成dmDT390的44条寡核苷酸引物,通过装配PCR将合成的基因片段连入pMD19-T载体,测序获得插入正确基因片段的pMD19-scfv(1)、pMD19-scfv (2)、pMD19-scfv (3) 和 pMD19-dmDT390载体。pMD19-scfv (1)和pMD19-scfv(2)经酶切拼接后最终连入pPICZalpha A载体形成了pPICZalpha A-biscfv表达载体；pMD 19-scfv(2)、pMD 19-scfv(3)和pMD19-dmDT390经酶切拼接后最终连入pPICZalphaA载体形成了pPICZalpha A-dmDT390-biscfv表达载体。2.经氯化锂转化法获得了稳定整合目的基因的毕赤酵母菌株。3.整合了biscfv目的基因的毕赤酵母菌,表达产物经SDS-PAGE(还原性)电泳分析,得到分子量约为55kd表达产物,western blot验证含组氨酸尾,为目的蛋白。4.整合了dmDT390-biscfv目的基因的毕赤酵母菌,表达产物经SDS-PAGE(非还原性)电泳分析,得到分子量约为95kd表达产物,western blot验证含组氨酸尾,为目的蛋白。5.经镍柱纯化的蛋白经高效液相色谱仪检测纯度大于99%。结论重组毕赤酵母GS115能稳定表达biscfv和dmDT390-biscfv蛋白,蛋白经镍柱纯化后能获得高纯度的蛋白。