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苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)是世界性分布最广的一类苹果潜隐性病毒，该病毒会导致树体衰弱、产生慢性病害，严重影响果树的生长发育。繁育无毒苗木是目前苹果病毒病害最为有效的防治措施。但ACLSV在常规品种上不表现明显症状，加之树体大、病毒含量受气候因素影响，在不同生育期病毒在树体内分布不均，影响了病毒的检测效率。因此，了解病毒在植株体内的分布规律是准确诊断的前提，也是果树无毒栽培的基本保障。本研究利用实时荧光定量RT-PCR技术，对苹果不同生长发育时期、不同组织部位ACLSV进行测定，揭示病毒分布规律，为ACLSV的准确诊断及无毒苗木生产奠定基础。病程相关蛋白(PR)在植物抵御疾病、响应外界压力以及适应不良环境方面发挥着重要作用。PR10是目前唯一被证明与病毒互作的PR成员。我们前期构建了苏俄苹果cDNA文库，筛选并证明了PR10与ACLSV CP、P50的互作，本研究进一步测定并分析了苏俄苹果PR10序列，构建了PR10过表达及RNAi干涉载体，为探究ACLSV与寄主互作机制奠定了基础。取得的具体研究结果如下: 1、ACLSV实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及优化 对检测体系进行了建立和优化。测定了内参基因和病毒基因引物特异性，确定病毒特异性引物最佳引物浓度为10μmol/L、最佳退火温度为57℃，优化后的检测体系灵敏度为10-6模板稀释液，并且验证了该方法在田间检测中的可靠性。 2、ACLSV在苹果植株体内的分布 采用实时荧光定量RT-PCR技术，对2015年9月中旬至2016年4月中旬苹果树体内ACLSV基因相对表达量进行了测定。从组织部位、树体方位和生长发育时期3个角度对病毒含量变化进行了分析，结果表明:(1)从组织部位角度分析，在苹果的盛花期，ACLSV在花中的含量最高，叶最低，ACLSV含量由高到低的顺序依次为:花、两年生枝条树皮组织、芽、一年生枝条树皮组织和叶。(2)从树体方位角度分析，在苹果一年生枝条树皮组织中，ACLSV在4个方位上的病毒含量差异比较显著，位于南向的病毒含量最高，西向最低。(3)从生长发育时期角度进行分析，苹果一年生枝条树皮组织中，病毒含量是从9月中旬到10月中旬大幅度升高，10月中旬达到这8个月份中的最高峰，此后病毒含量开始下降，3月起呈上升趋势。 3、苏俄苹果PR10分子克隆及序列分析 以苏俄苹果组培苗为材料，RT-PCR扩增PR10基因片段，进行分子克隆及序列分析。结果表明，测得的苏俄苹果PR1011条序列，有效序列分为4种:苏俄PR10-11为一种，GenBank登录号为KX249594;PR10-16为一种，GenBank登录号为KX249595; PR10-3和PR10-15-1相同，GenBank登录号为KX249596; PR10-2、PR10-5、PR10-7、PR10-13、PR10-15序列相同， GenBank登录号为KX249597。我们选择了所占比例最多的一种，作为后续基因超表达和RNAi载体构建的对象。 4、苏俄苹果PR10过表达及RNAi干涉载体的构建 以苏俄苹果PR10家族中最常见的PR10(登录号为:KX249597)为模板，分别扩增出正、反义两条片段，与双元质粒pBI121载体进行连接，构建正、反义表达载体pBI PR10sense和pBIPR10antisense，作为后续苏俄苹果PR10超表达的研究对象;分别扩增出PR101-487 nt的长片段和204-487 nt的短片段，以正反两个方向插入到pBI121中，得到RNAi载体pBIPR10RNAi，作为后期苏俄苹果PR10沉默的研究对象。