流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。频繁暴发的季节性流感以及不确定的流感大流行严重危害人类健康并造成巨大经济损失。鉴于流感疫苗开发相对滞后且M2抑制剂对人体产生副作用及现有毒株对其已产生耐药性，以流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂为代表的抗流感药物成为迄今为止对抗流感最有效的策略。NA是流感病毒表面的一种糖蛋白，其主要功能是促进新生病毒从宿主细胞上释放，在流感病毒的复制和传播中具有重要作用。除近期从蝙蝠体内分离到的NA样N10和N11亚型外，A型流感病毒的NA共有九种血清型，依据其一级结构序列可分为两组:第一组（N1，N4，N5和N8）和第二组(N2，N3，N6，N7和N9)。除09N1以外，第一组NA都具有150-洞（由147-152位氨基酸组成的loop称为150-loop，开放的150-loop称为150-洞）。第二组NA不具有150-洞。150-loop是由NA活性位点附近的氨基酸构成，对于抑制剂的结合起重要作用。新型抑制剂研发的其中一个重要方向就是靶向150-洞。，因此研究150-洞的形成机制及其与抑制剂之间的关系对于新型流感病毒抑制剂的研发具有重要意义。　　本文在对N2亚型NA与小分子抑制剂oseltamivir carboxylate和zanamivir的结构研究中发现，N2的150-loop在一定条件下可以形成开放状态的150-loop，而D147在形成开放的150-loop中起重要作用。另外我们与上海药物所合作，通过分子动态模拟，阐明了N2亚型NA的150-洞的动态形成机制，表明抑制剂的研发需考虑到蛋白自身的柔性及小分子对蛋白的诱导作用。神经氨酸酶抑制剂通过竞争性的结合NA的活性中心，抑制NA活性，阻止子代病毒颗粒在宿主细胞的复制与释放，从而有效地预防流感和缓解症状。目前临床上常用的NA抑制剂有达菲(oseltamivir)、瑞乐沙(zanamivir)、帕拉米韦(peramivir)和拉尼那米韦(laninamivir)。其中拉尼那米韦主要在日本应用，帕拉米韦也只在少数国家被允许用于临床治疗。2013年3月在中国的上海和安徽两地率先发现人感染禽源H7N9病毒的病例。这种新亚型的流感病毒跨种间传播对人类的健康造成了巨大威胁。截止至2013年8月，我国内地共报告134例人感染H7N9禽流感确诊病例，其中死亡45人。序列分析表明此次流行的H7N9至少存在两种不同的NA和HA。与之前的N9序列相比，此次分离到的H7N9病毒NA的茎部区有5个氨基酸的缺失。此次H7N9代表性毒株为A/Anhui/1/2013（简称安徽株）和A/Shanghai/1/2013（简称上海株）。这两种NA有两个氨基酸位点不同，其中包括与底物结合的294位氨基酸(N9序列编码)。安徽株的第294位是精氨酸，而上海株是赖氨酸。已有研究表明，294位氨基酸与底物/抑制剂的羧基直接相互作用，K294可导致达菲及瑞乐沙耐受。由于H7N9病毒对于M2离子通道抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺具有耐药性，因此神经氨酸酶抑制剂(NAI)是治疗感染H7N9病毒的病人最主要的药物。现用于临床的神经氨酸酶抑制剂主要有四种:达菲、瑞乐沙、帕拉米韦和拉尼那米韦。　　本文利用昆虫表达系统得到安徽N9(R294)和上海N9(K294)蛋白，证明了K294使NA活性明显降低。且带有K294的N9对于oseltamivircarboxylate、zanamivir、peramivir和laninamivir均有不同程度的耐药。另外，我们利用反向遗传系统包装的病毒也证明了带有K294的病毒的NA活性明显下降，并导致该病毒的复制效率比带有R294的病毒低。这个结果解释了从临床病例中分离到的带有K294的病毒不能成为感染人的主要病毒的原因。我们进一步通过解析安徽N9和上海N9的native结构及其与不同抑制剂的复合物结构，阐明了K294的耐药机制。以上研究对于指导感染H7N9的病人用药具有重要意义。