论文部分内容阅读
研究背景:急性心肌梗死(AMI)是致死率较高的一类常见的心肌缺血性疾病,及时的血运重建有助于减少心肌的损伤,但是心肌梗死再灌注后会有不同程度的再灌注心肌损伤。不恰当的炎症反应是发生心肌再灌注损伤的重要机制。许多研究提示间充质干细胞(MSCs)在剧烈的炎症反应环境下可以通过对免疫细胞的调控来调节炎症反应。所以从调节炎症的角度,移植MSCs改善心肌梗死再灌注损伤的时间点应该在再灌注开始后。本研究旨在通过探讨AMI再灌注后即刻经冠脉移植人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)在改善心肌损伤,促进心肌修复及调控炎症中的作用及其机制,优化AMI再灌注损伤的干细胞治疗方案。研究方法:1、体外扩增培养HUCMSCs,并以Ferumoxytol-PLL标记HUCMSCs,流式鉴定细胞表面标志物;2、球囊封堵实验用小型猪冠状动脉左前降支远端90分钟,恢复血流制作急性心肌梗死再灌注模型;3、实验分组:分为三组:(1)对照组:猪心肌梗死再灌注后即刻经冠脉注入PBS;(2)HUCMSC组:猪心肌梗死再灌注后即刻经冠脉注入5x10~7的HUCMSCs;(3)HUCMSC+Cs A组:再灌注前20分钟静脉滴注Cs A,猪心肌梗死再灌注后即刻经冠脉注入5x10~7的HUCMSCs;4、移植前、移植后24h、1周及2周进行CMR影像学检查,T2*观察移植细胞归巢情况;心肌首过灌注成像观察局部心肌血流灌注情况;延迟增强观察梗死心肌体积;心脏电影成像观察局部心脏功能状态;5、2周后处死动物,取梗死、梗死周围区及正常区包埋固定并制作石蜡切片;普鲁士蓝染色观察含铁细胞的分布;Masson染色检测局部心肌胶原沉积;Ki67免疫组化检测细胞增殖情况;v WF免疫组化观察血管新生情况;Caspase3免疫组化检测细胞凋亡情况;CD68免疫组化检测心肌局部巨噬细胞的浸润情况;CD3免疫组化检测T细胞的浸润情况;TUNEL和CD3免疫荧光双染检测T细胞的凋亡;Ki67和CD3免疫荧光双染检测T细胞的增殖情况;免疫荧光检测Fox P3+细胞在心梗区的分布;不同的时间点(造模前、急性心肌梗死再灌注后24h、4天、7天、14天)外周血中提取淋巴细胞,流式细胞仪检测CD4+CD25+foxp3+Treg(Treg)细胞占CD4+T细胞的比例。研究结果:1、传代培养至P6后HUCMSCs表面标志物无变化,高表达CD73、CD90、CD105、CD44,低表达CD19、CD11b、CD34、CD45、HLA-DR、HLA-DQ。2、延迟增强成像显示各个检测时间节点HUCMSC组较对照组梗死体积均要小(P<0.05);术后HUCMSC组和对照组的LVEF均较术前有所下降,两组间无显著差异;心肌首过灌注显示HUCMSC组移植后24h心梗核心区灌注值低于对照组(P<0.01),1周后HUCMSC组高于对照组但无统计学差异;HUCMSC组未发现明显的T2*WI低信号影;HUCMSC组普鲁士蓝染色可见多处片状蓝染颗粒细胞;HUCMSC组胶原沉积面积比低于对照组(p<0.05);HUCMSC组梗死核心区及梗死周边区新生血管密度要高于对照组(p<0.001);Ki67检测显示HUCMSC组在心梗区和心梗周边区的增殖细胞数高于对照组(p<0.001);Caspase3检测显示HUCMSC组在心梗区和心梗周边区的细胞凋亡率明显低于对照组(p<0.001);HUCMSC组在梗死核心区CD3阳性T细胞明显多于对照组(p<0.001);而梗死核心区CD68阳性巨噬细胞HUCMSC组明显少于对照组(p<0.001);HUCMSC组CD3阳性T细胞的凋亡率要明显低于对照组((p<0.001);梗死核心区Fox P3+细胞HUCMSC组明显多于对照组(p<0.05);术后第4天对照组的外周血CD4+CD25+foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例明显上升,显著高于HUCMSC组(P<0.05)。结果显示AMI再灌注后即刻经冠脉移植HUCMSCs具有一定的心肌保护作用,其机制可能是通过对免疫细胞尤其是T细胞的作用来实现。3、干细胞移植的同时加用Cs A后,发现HUCMSC+Cs A组梗死体积高于HUCMSC组(P<0.05);术后各时间节点HUCMSC+Cs A组LVEF下降显著,明显低于HUCMSC组(p<0.001);心肌首过灌注显示各个时间节点HUCMSC+Cs A组均低于HUCMSC组;普鲁士蓝染色HUCMSC+Cs A组蓝染颗粒细胞数较HUCMSC组少(P<0.01);HUCMSC+Cs A组胶原沉积面积比高于HUCMSC组(p<0.05);HUCMSC+Cs A组梗死核心区及梗死周边区新生血管密度要低于HUCMSC组(p<0.001);HUCMSC+Cs A组在心梗区和心梗周边区的增殖细胞数低于HUCMSC组(p<0.001);HUCMSC+Cs A组在梗死核心区CD3阳性T细胞明显低于HUCMSC组(p<0.001);HUCMSC+Cs A组CD3阳性T细胞的凋亡率要高于HUCMSC组(p<0.001);梗死核心区Fox P3+细胞数HUCMSC+Cs A组明显少于HUCMSC组(p<0.05)。结果显示免疫抑制剂抑制T细胞的活性,抑制炎症反应后,逆转了即刻经冠脉移植HUCMSCs后对AMI再灌注后心肌的保护作用。研究结论:再灌注即刻经冠脉移植HUCMSCs是治疗AMI再灌注心肌损伤的合适方案。HUCMSCs通过和T细胞的相互作用调节炎症反应,继而发挥心肌保护作用。