黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)又称黄腊丁。随着捕捞强度的日益增加和水生态环境的恶化,黄颡鱼人工繁殖时鱼巢的选择与利用显得迫在眉睫。黄颡鱼属底栖型鱼类,其繁殖时用于产卵的人工鱼巢可为亲本有效繁殖和个体生长发育提供良好的环境。Period 2作为时钟基因的下游分子之一,其表达产物在细胞质中聚集达到峰值后转移至细胞核,与CRY形成寡聚物,进而抑制自身的转录表达,调控鱼类的生殖活动。昼夜节律基因作为多种生物生命活动过程中的调控因子,已成为影响其生长繁殖的重要因素,因此有必要研究时钟基因Period 2在硬骨底栖型鱼类繁殖期间的确切作用。本研究中探究了黄颡鱼繁殖时期对几种鱼巢产卵偏好性的问题,克隆了黄颡鱼Period 2基因c DNA序列全长并对其进行了分析。同时对黄颡鱼亲本繁殖过程血液中以及个体发育过程中Period 2的表达量进行监测,并对前期个体发育过程中的蛋白进行定位。取得了以下成果:1. 探索黄颡鱼繁殖时期对人工鱼巢的偏好性,2018年6-7月开展了不同水温条件下,黄颡鱼对不同鱼巢颜色和材质产卵偏好性的对比实验。实验用产卵鱼巢为半球形棕榈空鱼巢(直径25 cm,深12 cm);同规格内部放置4～6枚碎石块棕榈鱼巢和塑料鱼巢;折叠6层尼龙渔网(30 cm×40 cm)和棕榈片(30 cm×40 cm)鱼巢,于水泥池(290 cm×120 cm×100 cm)内开展两种温度区间条件下产卵偏好性实验。实验用黄颡鱼亲本雌雄比例为1:1,雌鱼体长(167.8±19.0)mm,体重(99.9±21.7)g;雄鱼体长(235.1±18.8)mm,体重(188.5±38.1)g。结果表明,在24～26℃水环境下,半球形棕色棕榈(无石子)鱼巢内个体平均附卵量为628.49粒/m~2,个体单位面积平均附卵率为2.77%;28～32℃水环境下,半球形棕榈(无石子)个体平均附卵量为225.48粒/m~2,个体单位面积平均附卵率为1.40%。结果分析发现,24～26℃是黄颡鱼产卵的最适水温区间;黄颡鱼对棕色鱼巢产卵偏好显著(P<0.05),而灰色、粉色、黄色和绿色无明显偏好;黄颡鱼对半球形棕榈(无石子)鱼巢产卵偏好显著(P<0.05);而对其他材质鱼巢的偏好性依次为:半球形棕榈(有石子)>平铺棕榈片>悬挂棕榈片>半球形塑料>水泥池。可见,黄颡鱼产卵的最佳偏好为24～26℃水环境下棕色半球形棕榈鱼巢。本研究结果对黄颡鱼的人工繁殖、产沉粘性卵鱼类产卵场的修复和资源增殖有重要的指导意义。2. 黄颡鱼c DNA序列分析结果显示,Period 2基因的c DNA全长序列为4593bp,包含357bp的5’-非翻译区(5’UTR),216bp的3’-非翻译区(3’UTR)和4020 bp开放阅读框(ORF),编码1339个氨基酸。同源性和系统进化分析显示黄颡鱼Period 2 与斑点叉尾鮰Period 2同源性最高,进化关系较为密切。多个序列比对和系统进化分析表明,底栖鱼类相较于人类、鼠类和微生物与黄颡鱼具有极大的序列相似度。3. 黄颡鱼Period 2基因血液组织表达结果显示,总体雌、雄变化规律一致。雌性亲本产卵前后短时期内Period 2表达量比未催产时低,产卵时出现小的峰值。雄性亲本在雌性亲本产卵时出现一个峰值后回归未催产时期水平。相较于雄性,雌性产卵前后短时期内Period 2表达水平较低。雌性产卵时Period 2有向卵巢积聚的可能性。卵巢的成熟可能加速Period 2基因在卵巢的表达。4. 黄颡鱼Period 2基因个体组织表达结果显示,在个体胚胎发育早期,Period2明显呈现出较高的表达量。随着胚胎发育的进行和卵黄营养的被吸收,Period 2表现出持续下降趋势。表明Period 2的产生是直接引起的,因为自离开母体开始,受精卵可能即暴露于光线下并受光线的影响。而Period 2 m RNA转录水平表达的降低是由光照引起的。此过程中,SCN接收光信号,随之,松果体进行响应并分泌Period 2蛋白。此外,个体发育时期的进食和转食期间Period 2表达量明显增高,表明Period 2表达水平受外部其它环境的影响,例如营养摄入因子和消化因子。持续光照和外源性营养物质的摄入会加速Period 2的生成。本研究可以为外界环境对基因进、退化机制的研究提供新的思路。5. 黄颡鱼昼夜节律周期蛋白表达部分受SCN影响。自成为受精卵开始,Period2蛋白即受来源于母体的影响,可认为这是昼夜节律的一种类型。直到受精卵视网膜感受细胞发育后,环境对个体生长发育阶段产生更大的影响。在初始阶段,视网膜感受细胞发育和摄食对Period 2蛋白表达的影响规律不同,随着个体暴露于外部环境下的生长,尤其是光效应的累积,节律性振荡更加明显。6. 黄颡鱼免疫组织化学研究结果表明,卵黄中检测到Period 2蛋白印迹,表明黄颡鱼自母体开始携带Period 2蛋白。在大脑、肝脏、体表和肠的简单柱状上皮细胞中均检测到了Period 2蛋白的较强信号,并且Period 2蛋白主要在脑区域表达。Period 2可调节食物摄入量,IHC结果显示从第4天到第13天,个体的阳性信号结果微弱。但是,信号在膜破裂后第13天到19天增强。此外,在第16天和第19天,出现了小的峰值正信号。Period 2在脑中的分布稳定且规则。结果与定量m RNA表达模式高度一致。表明初始阶段的摄食和Period 2蛋白息息相关。Period2表达量和蛋白信号强度或许可作为黄颡鱼早期各发育阶段摄食的指标。