甲型流感病毒(Influenza A virus)持续变异并在人群中广泛传播，是造成人类致病性及死亡性的最重要病原体之一。因病毒的高度变异性，现有的疫苗及抗病毒策略的效率受到严重限制，本文就甲型流感病毒最重要的表面抗原血凝素蛋白(HA)在广谱单抗的诱导及应用方面的两个重要问题进行探讨，共由两部分组成。　　 其中第一部分旨在寻找流感病毒血凝素头部区的广谱单抗、鉴定广谱表位，并研究广谱单抗产生及作用的分子机制。HA蛋白是甲型流感病毒最主要的表面抗原，也是宿主免疫应答的主要攻击靶点，可诱导宿主产生保护性抗体及细胞免疫应答，是现行流感疫苗的关键性成分。为逃避宿主的免疫压力，HA表现出高度变异的特点，使得流感疫苗及治疗性药物需要不断更新。尽管如此，随着近年来对HA研究的深入，已发现在HA表面存在相对保守的表位可以诱导产生不同程度的广谱单抗。因此，进一步寻找流感病毒HA的广谱中和单抗以及所识别的保守表位，对流感的广谱治疗及广谱疫苗的开发具有重要意义。　　 本研究以H1N1亚型人流感病毒为研究对象，通过定期搜集分离人季节性及新型H1N1病毒，对病毒HA进行基因进化分析及病毒抗原性分析，挑选出代表性病毒进行广谱免疫策略摸索及常规单抗筛选，建立了一个含300多株H1亚型特异性单抗在内的总量达900多株各亚型HA特异性单抗的血凝素单抗库，根据单抗与代表性病毒的反应性，从单抗库中挑选了27株代表性单抗组成H1单抗盘，其中包括通过低剂量序贯免疫策略获得的7株跨HA交叉广谱单抗。　　 研究结果表明，以单抗12H5及G10D10为代表的7株广谱单抗具有H1及H5广谱交叉中和活性，其中单抗12H5能同时与季节性H1及新甲流H1反应，而单抗G10D10对1933年至今的大部分季节性H1病毒具有广谱反应性。动物实验证实单抗12H5及G10D10具有跨HA广谱治疗活性。两株单抗的识别表位均被定位于受体结合位点(RBD)附近，该区域是一个潜在的保守性广谱表位区。　　 采用单抗盘中对季节性H1病毒具有反应性的6类单抗（包括7株跨HA交叉广谱单抗），进行基于单抗基因的单抗聚类分析，根据单抗基因可将上述单抗划分为6个聚类(Cluster)，同时分析每一聚类单抗的识别表位及反应谱。结果表明，单抗盘基因谱系分析所反映出的规律和单抗表位分析的规律高度一致，每个聚类单抗识别相同的表位，且7株广谱单抗在单抗聚类上属于同一分支，单抗基因均来源于VGAM3.8 VH9重链基因家族及IGKV21轻链基因家族。同时，7株单抗均识别上述位于RBD附近的保守表位区。通过单抗同源建模及结构水平的分析证实，广谱单抗的特定基因来源决定了单抗的CDR区在结构上与其他非广谱单抗相区别，且区别主要集中于单抗轻链CDR1区及重链CDR3区;单抗与HA三聚体的分子对接结果进一步表明，广谱单抗与HA的结合主要依赖于上述的LCDR1区及HCDR3区，并巧妙地通过LCDR1区及HCDR3区插入到HA保守表位区与流感病毒HA相结合。　　 上述研究结果表明，流感病毒头部区存在广谱表位，通过特定的免疫方式，可以诱导针对该表位区的广谱单抗，广谱单抗在广谱表位定位及广谱抗病毒治疗方面均具有应用潜能;此外本部分研究还发现，单抗的广谱性与单抗轻重链的基因选择密切相关，广谱单抗的特定基因家族组合决定了单抗能够识别HA上的保守表位，从而决定了单抗的广谱反应性。　　 本文的第二部分对流感血凝素单抗在抗病毒治疗方面的应用展开研究，旨在探索甲型流感病毒血凝素特异性单抗的治疗潜能及潜在的治疗机制。单克隆抗体作为治疗性药物已在治疗恶性肿瘤、移植排斥反应、免疫相关疾病等领域广泛应用，并成为生物医药中最活跃的研究领域之一。对于流感等传染性疾病，由于普遍存在的因病毒持续变异而导致的药物耐药性及疫苗效率低下的问题，单克隆抗体也成为一个潜在的流感病毒预防及治疗新工具。　　 在第一部分研究中已初步证实，广谱单抗具有潜在的治疗潜能，在本部分研究中，对单抗的治疗特征及潜在的治疗机制进行更深入的探索。首先，本部分研究利用新甲流H1病毒的小鼠感染及致死模型，分析不同类型单抗的治疗潜能，结果发现，中和性单抗及部分非中和性单抗均具有高效治疗潜能。单抗的治疗具有剂量依赖性，其中中和性抗体6B9在1.25mg/kg的低剂量下就可以发挥100％的治疗效果，并且，单抗6B9治疗能够在24h内快速降低小鼠肺部的病毒量，并于48h内清除体内大部分病毒，体现了单抗治疗的高效性。同时，本研究首次提出了单抗经鼻给药治疗流感病毒的感染，并证实其治疗效果优于常规的尾静脉注射给药治疗，提示对于呼吸道疾病，经鼻给药的治疗途径是一个潜在的替代途径。　　 选取中和单抗6B9、14H2及非中和单抗9F1开展单抗治疗的机制研究，首先通过细胞水平试验证实，单抗6B9、14H2及9F1均不具备ADCC及CDC活性。动物实验发现中和单抗6B9、14H2的治疗作用主要依赖于单抗的中和作用，单抗F(ab’)2也能发挥治疗作用，而不依赖于单抗的Fc片段介导的ADCC及CDC作用;不同的是，非中和单抗9F1的治疗作用依赖于单抗的Fc片段，单抗F(ab’)2在单次给药及连续给药下均未能发挥治疗作用，随后通过单抗在Rag2-/-，Il2rg-/-免疫缺陷小鼠体内的治疗实验证实，T细胞、B细胞及NK细胞缺失不影响单抗9F1的治疗作用，进一步说明非中和单抗9F1的治疗机制不依赖ADCC及CDC作用，可能通过Fc介导的其他免疫效应途径起到治疗作用。　　 上述研究表明，血凝素单抗具有高效的动物保护效果，在低剂量下即可迅速清除被感染动物体内的病毒，同时本研究还发现经鼻给药的治疗途径在治疗效果上优于传统的静脉给药。此外，本研究还建立了细胞水平及动物水平的单抗治疗机制研究平台，证实了中和单抗的治疗机制主要基于单抗Fab的中和作用，而非中和单抗9F1的治疗作用主要依赖于Fc介导的除ADCC及CDC以外的其他免疫机制。