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Six1属于SIX转录因子家族(Sine oculis homeobox family,SIX),该基因家族是一类进化上保守的转录因子家族,在脊椎动物骨骼肌发生、发育过程中起着重要作用。骨骼肌胚胎发育过程依赖于复杂调控网络的精准调控,Six1基因是其中重要的成员,它在早期肌源细胞决定和迁移、肌纤维形成和肌细胞增殖、肌纤维类型的决定过程中都起着重要作用。以往的研究主要侧重对Six1在哺乳动物早期肌肉发生中的作用,对在胚胎发育以及胚胎形成后的研究较少。本试验以鸭为研究对象,通过克隆Six1基因mRNA序列,采用实时荧光定量法对Six1基因在30日龄鸭13个组织的相对表达量进行检测,研究Six1基因组织差异表达特征,并以鸭胚胎不同发育阶段及出雏后的胸肌和腿肌为试验对象,研究骨骼肌中Six1基因的发育性表达规律,再通过成肌细胞培养和Six1基因脂质体转染试验,探讨其在成肌细胞中对肌生成决定因子MyoD和Myf5基因的转录调控作用,以初步解释Six1基因在鸟类中的部分功能。结果表明:
1.通过RT-PCR方法克隆鸭Six1基因cDNA序列,获得序列1154bp,其中编码区全序列(Coding domain sequences,CDS)全长849bp,共编码282个氨基酸;不同物种间Six1同源性比对结果表明Six1基因在物种间高度保守。
2.生物信息学分析表明:鸭Six1蛋白具有Homeodomain保守域结构,在Homeodomain的N端存在另一个保守区域,推测其为鸭Six1的蛋白互作结构域Sixdomain。
3.鸭Six1基因在30日龄鸭不同组织中表达水平差异显著(P＜0.05),其中以胸肌中表达水平最高,其次是腿肌,再次是胰脏、肺和脾脏;30日龄鸭不同组织中Six1基因表达水平不存在性别差异(P＜0.05)。
4.通过荧光定量检测了鸭SixJ基因在胚胎期胸肌和腿肌中的发育表达模式,结果表明鸭Six1基因在两种肌肉组织中具有相似的表达模式,表达量随胚龄呈上升趋势;2日龄雏鸭Six1基因相对表达量较出雏前显著下调;从2日龄开始,鸭SixJ在胸肌中的相对表达量呈上升趋势;从2日龄开始至8周龄,鸭SixJ在腿肌中的相对表达量呈上升趋势。鸭腿肌中的Six1相对表达量在11月龄时低于8周龄的水平。
5.本研究构建了鸭Six1基因的转染载体(pEGFPN1-Six1),将其转染至体外培养的鸭成肌细胞中,经荧光定量检测后发现处理组Six1、Myf5和MyoD基因转录水平极显著高于对照组(P＜0.01);Six1转录因子蛋白在鸭成肌细胞中调控着Myf5和MyoD基因的转录。