结肠癌是消化系统常见的实体肿瘤,也是恶性肿瘤导致死亡的重要病因之一。过去几十年的研究表明结肠癌是多种基因异常表达共同作用的结果,但其发病的机制仍未完全阐明。作为一种常见的实体肿瘤,缺氧是其发生发展过程中的一个固有特点。研究表明HIF1-α在缺氧微环境中通过调控数百种靶基因,从而维持肿瘤细胞的存活。课题组前期通过干扰结肠癌细胞HIF1-α基因后进行蛋白质组学分析发现PLD2的变化明显。由此,我们推测在结肠癌中PLD2与HIF1-α可能具有相关性,并且受其调控,从而维持结肠癌细胞在缺氧的微环境得以存活。然而,目前尚未见在结肠癌中HIF1-α与PLD2关系及作用意义的文献报道,因此其具有重要的研究价值。本研究分以下三部分进行:第一部分HIF1-α与PLD2在结肠癌组织中的表达及临床意义目的:探讨HIF1-α与PLD2在结肠癌组织中的表达及相关性。方法:应用免疫组织化学染色法检测30例结肠癌组织及相对应的正常结肠粘膜组织中HIF1-α与PLD2蛋白的表达情况,探讨它们与临床病理参数之间的关系,并分析两者表达之间的相关性;分别用Western Blot和RT-PCR检测HIF1-α与PLD2在结肠癌及相对应的正常结肠粘膜中蛋白和mrna的表达水平。结果:免疫组织化学染色结果显示30例结肠癌组织中hif1-α与pld2蛋白的阳性表达率分别为76.67%(23/30)和73.33%(22/30),与两者在正常结肠粘膜组织中阳性表达率相比差异具有统计学意义(p<0.05),两者共同表达与肿瘤的大少呈正相关,spearman相关性分析结果示结肠癌组织中hif1-α与pld2蛋白表达水平呈正相关(r=0.56,p<0.05);rt-pcr和westernblot检查结果提示30例结肠癌组织中hif1-α与pld2mrna和蛋白均呈高表达,与正常结肠粘膜组织中表达水平相比差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:hif1-α与pld2在结肠癌组织中表达较正常结肠粘膜增高,两者共表达与患者的肿瘤大小有关,且两者表达水平呈正相关。第二部分缺氧微环境中hif1-α上调结肠癌细胞pld2表达的研究目的:从体内外实验探讨缺氧微环境中hif1-α对结肠癌细胞pld2表达水平的调控作用。方法:首先用westernblot和rt-pcr检测不同结肠粘膜起源细胞系(sw480,sw620,hct116,lovo及fhc)中hif1-α和pld2的mrna和蛋白的表达水平;再通过低氧培养模拟缺氧微环境并培养不同时间(0h,12h,24h及48h),用rt-pcr和westernblot检测缺氧对结肠癌细胞(sw480和sw620)中hif1-α和pld2mrna和蛋白表达水平的影响;用rt-pcr和westernblot检测干扰hif1-α基因后对缺氧培养24h或者不同氯化钴浓度(0,100μm,200μm)条件下培养的结肠癌细胞(sw480和sw620)中pld2mrna和蛋白的表达水平;最后建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,干扰hif1-α基因表达,观察裸鼠移植瘤生长情况,并用免疫组化和westernblot检测移植瘤中pld2蛋白的表达水平。结果:结肠癌细胞中(sw480,sw620,hct116及lovo)hif1-α与pld2mrna和蛋白的表达水平较fhc明显升高(p<0.05);缺氧导致结肠癌细胞(sw480,sw620)中hif1-α与pld2的mrna和蛋白的表达水平较常氧升高(p<0.05);成功构建携带人hif1-α基因sirna的腺病毒载体,转染结肠癌细胞(sw480,sw620),导致结肠癌细胞(sw480,sw620)中hif1-αmrna和蛋白的表达水平在常氧和缺氧条件下与各自对照组相比均降低(p<0.05);干扰降低hif1-α基因的表达导致缺氧诱导的结肠癌细胞(sw480,sw620)中pld2蛋白和mrna的表达水平降低,与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05);不同浓度氯化钴上调hif1-α的表达导致结肠癌细胞(sw480,sw620)中pld2蛋白和mrna表达水平随氯化钴浓度升高而升高,与对照组(0μm)相比差异具有统计学意义(p<0.05);结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长曲线显示hif1-α干扰组移植瘤从第21天开始肿瘤体积小于对照组(p<0.05),免疫组化和westernblot结果均示,hif1-α干扰组移植瘤中的pld2蛋白表达的水平明显低于空白对照组(p<0.01)。结论:hif1-α上调体内外缺氧微环境中结肠癌细胞pld2的mrna和蛋白的表达水平,阻断hif1-α和pld2的表达对裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用。第三部分抑制pld2活性对缺氧微环境中结肠癌细胞凋亡的影响及机制研究目的:通过抑制pld2活性,探讨其对缺氧微环境中结肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:首先用磷脂酶d活性实验检测缺氧对结肠癌细胞(sw480、sw620、lovo和hct116)及fhc磷脂酶d活性的影响;再用磷脂酶d活性实验检测不同浓度(50nm,100nm)的pld2活性抑制剂(vu0364739)对缺氧诱导的结肠癌细胞(sw480和sw620)及fhc中磷脂酶d活性的影响,三种细胞株均分为:常氧组(basal组)、缺氧组(control组)、缺氧+vu0364739(50nm)及缺氧+vu0364739(100nm);利用流式细胞术检测抑制pld2活性对缺氧微环境中结肠癌细胞(sw480和w620)和fhc凋亡的影响,利用westernblot检测抑制pld2活性对缺氧环境中结肠癌细胞(sw480和sw620)和fhc中survivin、bcl2、p-pi3k/pi3k及p-akt/akt蛋白表达水平的影响,分组同上;sw620和sw480均分为:缺氧对照组、缺氧+vu0364739(100nm)组、缺氧+ly294002(10μm)组、缺氧+ly294002(10μm)+vu0364739(100nm)组,各组细胞的凋亡率用流式细胞检测,用westernblot检测各组细胞中survivin、bcl2、p-pi3k/pi3k及p-akt/akt蛋白的表达水平;最后用免疫组织化学染色检测50例结肠癌组织及相对应的正常结肠粘膜组织中pld2、survivin和bcl2的表达,并用spearman相关分别分析pld2与survivin和bcl2表达水平之间的相关性。结果:结肠癌细胞(sw480、sw620、lovo和hct116)及fhc中缺氧组的pld活性较常氧组升高,两组之间差异具有统计学意义(p<0.05);vu0364739能显著抑制缺氧诱导升高的结肠癌细胞(sw620和sw480)及fhc中pld活性,缺氧+vu0364739(50nm)组或者缺氧+vu0364739(100nm)组与缺氧对照组相比差异具统计学意义(p<0.05);缺氧导致结肠癌细胞(sw620和sw480)及fhc的凋亡率较basal组增加(p<0.05),而抑制pld2活性后导致缺氧诱导的结肠癌细胞(sw480和sw620)凋亡增加更加明显,缺氧+vu0364739(50nm)组或者缺氧+vu0364739(100nm)组与缺氧对照组相比差异具统计学意义(p<0.05),而对fhc凋亡无明显影响,缺氧+vu0364739(50nm)组或者缺氧+vu0364739(100nm)组与缺氧对照组相比差异无统计学意义(p>0.05);缺氧导致结肠癌细胞(sw620和sw480)及fhc的survivin、bcl-2、p-pi3k/pi3k及p-akt/akt蛋白表达水平较basal组升高(p<0.05),抑制pld2活性后导致缺氧诱导的结肠癌细胞(sw620和sw480)中survivin、bcl-2、p-pi3k/pi3k及p-akt/akt的蛋白表达水平又降低,缺氧+vu0364739(50nm)组或者缺氧+vu0364739(100nm)组与缺氧对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05),而对fhc中这些因子的蛋白表达水平无明显影响,缺氧+vu0364739(50nm)组或者缺氧+vu0364739(100nm)组与缺氧对照组相比差异无统计学意义(p>0.05);抑制pi3k/akt信号通路、抑制pld2活性、或者两种方法相结合均导致缺氧诱导的结肠癌细胞(sw480和sw620)中survivin、bcl-2、p-pi3k/pi3k及p-akt/akt蛋白表达水平均降低,同时伴有这些细胞凋亡率增加,这三组细胞与缺氧对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),而缺氧+LY294002(10μM)组与缺氧+VU0364739(100nM)组、缺氧+LY294002(10μM)组与缺氧+LY294002(10μM)+VU0364739(100nM)组以及缺氧+VU0364739(100nM)组与缺氧+LY294002(10μM)+VU0364739(100nM)组间相比这些因子蛋白表达和凋亡率变化的差异均不明显(P>0.05);PLD2,Survivin及Bcl2在50例结肠癌组织中阳性表达率为分别为64%、68%和60%,与正常组织中这些因子的阳性表达率相比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),同时相关性分析结果显示PLD2与Survivin(r=0.379,P<0.05),PLD2和Bcl2(r=0.405,P<0.05)蛋白表达水平均呈正相关。结论:缺氧微环境中,PLD2可能通过激活PI3K/AKT信号通路上调Survivin和Bcl2的表达水平,从而抑制结肠癌细胞的凋亡。