论文部分内容阅读
背景与目的：
全氟辛烷磺酸（PFOS）广泛存在于自然环境及生物体内。流行病学调查结果显示，PFOS的内暴露可导致成年男性精子数量减少，女性月经初潮年龄推迟和妊娠时间延长。实验动物经PFOS暴露展现出其潜在的生殖毒性及内分泌干扰特性。然而很少有研究系统性地探索PFOS对于成年斑马鱼生殖行为以及下丘脑-垂体-性腺-肝脏（HPGL）轴上生殖相关基因表达的影响。由于激素分泌具有时间节律性，不同时间点暴露PFOS后HPGL轴表达情况的改变也值得探讨。因此本研究根据雄性斑马鱼以及雌性斑马鱼的特征，针对性地选取相关参数进行探索。对于雄鱼部分旨在探索PFOS对于成年雄性斑马鱼生殖行为以及性腺轴基因的相对表达情况；雌鱼部分探索不同时间点PFOS暴露后对其产力、雌激素水平以及性腺轴基因的表达情况，更加全面而系统地评价PFOS对成年斑马鱼的毒性作用。
材料与方法：
20条成年雄性斑马鱼经0、2、20、200μg/LPFOS和5μg/L雌二醇(E2)暴露21天后，染毒雄鱼与未染毒雌鱼交配，用相机记录其生殖行为。行为记录结束后，雄鱼称重测体长。然后分别取脑、肝、性腺称重后用于后续定量PCR法检测脑部基因（促性腺激素释放激素（GnRH）、促性腺激素释放激素受体（GnRHr）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）），肝脏基因（卵黄蛋白原（VTG）1、卵黄蛋白原（VTG）3、雌激素受体（ER）α、雌激素受体（ER）β），性腺基因（卵泡刺激素受体（FSHr）、黄体生成素受体（LHr）、雄激素受体（Ar）基因）的表达水平。
将80条雌性斑马鱼分别在上午八点和晚上七点经0、2、20和200μg/LPFOS暴露21天。21天后，在上午八点和晚上七点将每条染毒雌鱼分别与一条未染毒雄鱼配对，收集受精卵。产卵结束后，每组中的6条雌鱼在相应的时间点被称重测体长，然后分别取脑、肝脏和性腺组织用于脑部基因（GnRH、GnRHr、FSH、LH），肝脏基因（VTG1、ERα），性腺基因（FSHr、LHr、细胞色素P450（CYP）19基因）表达水平检测。各组中的剩余4条鱼也根据暴露时间分别在上午八点和晚上七点被匀浆后测定雌激素水平。
结果：
经PFOS暴露后，成年雄性斑马鱼性行为中“首尾接触”和“交尾”频率明显降低（P=0.046;P=0.031）。雄鱼经200μg/LPFOS暴露后，HPGL轴上脑部基因GnRH和GnRHr基因的表达水平相较于对照组明显下调（P=0.032;P=0.006）。肝脏基因中，VTG1和ERβ只在5μg/LE2暴露组呈现相对下调趋势（P=0.044;P=0.007）。性腺基因中，与对照组相比，FSHr和LHr在各PFOS暴露组和E2暴露组表达水平均降低（P=0.016;P=0.050），而Ar只在2和200μg/LPFOS组表达水平相对下调(P=0.038;P=0.026)。
上午八点成功产卵的雌性斑马鱼数量明显多于晚上七点的产卵斑马鱼数量（P=0.011），因而上午八点收集到的受精卵数量较多。PFOS暴露后，雌鱼脑部基因GnRH、GnRHr、FSH和LH在上午八点和晚上七点的表达水平均有差异（P=0.017;P=0.045;P=0.037;P=0.030）。与上午八点相比，晚上七点肝脏基因VTG1和ERα的表达量有所下调(P=0.021;P=0.010)。性腺中，CYP19基因在两个时间点的表达量不同（P=0.004）。上午八点暴露时，20μg/LPFOS暴露组，E2水平上升造成GnRHr基因代偿性下调以及VTG1和ERα基因表达上调。而晚上七点暴露时，并未发现蛋白基因水平代偿性改变。
结论：
1.PFOS对雄鱼产生生殖毒性和内分泌干扰作用表现为改变了雄性斑马鱼生殖行为和HPGL轴上基因表达水平；性腺基因与大脑和肝脏基因相比对PFOS产生的毒作用更敏感。2.雌性斑马鱼在上午八点比晚上七点产力更强；其在上午八点对PFOS暴露引起的生殖及内分泌毒性作用效应及相关基因表达更加明显；不同暴露时间会影响经不同浓度PFOS染毒后基因表达的敏感性。
3.PFOS对不同性别成年斑马鱼的毒性作用有差别，可根据雌鱼雄鱼不同特征有针对性地选取合适的参数进行描述。
4.经PFOS暴露后，斑马鱼生殖内分泌相关指标均发生变化。从基因、激素以及表型等不同层面分析PFOS对斑马鱼的影响，并探索它们之间的相互作用规律，有助于系统性地阐述PFOS对成年斑马鱼的毒作用机制。
5.激素分泌具有节律性，参照性激素的分泌特征选取恰当的时间点研究PFOS对斑马鱼生殖内分泌相关基因、激素以及表型的改变，才能更完整准确地阐明其毒性作用。
全氟辛烷磺酸（PFOS）广泛存在于自然环境及生物体内。流行病学调查结果显示，PFOS的内暴露可导致成年男性精子数量减少，女性月经初潮年龄推迟和妊娠时间延长。实验动物经PFOS暴露展现出其潜在的生殖毒性及内分泌干扰特性。然而很少有研究系统性地探索PFOS对于成年斑马鱼生殖行为以及下丘脑-垂体-性腺-肝脏（HPGL）轴上生殖相关基因表达的影响。由于激素分泌具有时间节律性，不同时间点暴露PFOS后HPGL轴表达情况的改变也值得探讨。因此本研究根据雄性斑马鱼以及雌性斑马鱼的特征，针对性地选取相关参数进行探索。对于雄鱼部分旨在探索PFOS对于成年雄性斑马鱼生殖行为以及性腺轴基因的相对表达情况；雌鱼部分探索不同时间点PFOS暴露后对其产力、雌激素水平以及性腺轴基因的表达情况，更加全面而系统地评价PFOS对成年斑马鱼的毒性作用。
材料与方法：
20条成年雄性斑马鱼经0、2、20、200μg/LPFOS和5μg/L雌二醇(E2)暴露21天后，染毒雄鱼与未染毒雌鱼交配，用相机记录其生殖行为。行为记录结束后，雄鱼称重测体长。然后分别取脑、肝、性腺称重后用于后续定量PCR法检测脑部基因（促性腺激素释放激素（GnRH）、促性腺激素释放激素受体（GnRHr）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）），肝脏基因（卵黄蛋白原（VTG）1、卵黄蛋白原（VTG）3、雌激素受体（ER）α、雌激素受体（ER）β），性腺基因（卵泡刺激素受体（FSHr）、黄体生成素受体（LHr）、雄激素受体（Ar）基因）的表达水平。
将80条雌性斑马鱼分别在上午八点和晚上七点经0、2、20和200μg/LPFOS暴露21天。21天后，在上午八点和晚上七点将每条染毒雌鱼分别与一条未染毒雄鱼配对，收集受精卵。产卵结束后，每组中的6条雌鱼在相应的时间点被称重测体长，然后分别取脑、肝脏和性腺组织用于脑部基因（GnRH、GnRHr、FSH、LH），肝脏基因（VTG1、ERα），性腺基因（FSHr、LHr、细胞色素P450（CYP）19基因）表达水平检测。各组中的剩余4条鱼也根据暴露时间分别在上午八点和晚上七点被匀浆后测定雌激素水平。
结果：
经PFOS暴露后，成年雄性斑马鱼性行为中“首尾接触”和“交尾”频率明显降低（P=0.046;P=0.031）。雄鱼经200μg/LPFOS暴露后，HPGL轴上脑部基因GnRH和GnRHr基因的表达水平相较于对照组明显下调（P=0.032;P=0.006）。肝脏基因中，VTG1和ERβ只在5μg/LE2暴露组呈现相对下调趋势（P=0.044;P=0.007）。性腺基因中，与对照组相比，FSHr和LHr在各PFOS暴露组和E2暴露组表达水平均降低（P=0.016;P=0.050），而Ar只在2和200μg/LPFOS组表达水平相对下调(P=0.038;P=0.026)。
上午八点成功产卵的雌性斑马鱼数量明显多于晚上七点的产卵斑马鱼数量（P=0.011），因而上午八点收集到的受精卵数量较多。PFOS暴露后，雌鱼脑部基因GnRH、GnRHr、FSH和LH在上午八点和晚上七点的表达水平均有差异（P=0.017;P=0.045;P=0.037;P=0.030）。与上午八点相比，晚上七点肝脏基因VTG1和ERα的表达量有所下调(P=0.021;P=0.010)。性腺中，CYP19基因在两个时间点的表达量不同（P=0.004）。上午八点暴露时，20μg/LPFOS暴露组，E2水平上升造成GnRHr基因代偿性下调以及VTG1和ERα基因表达上调。而晚上七点暴露时，并未发现蛋白基因水平代偿性改变。
结论：
1.PFOS对雄鱼产生生殖毒性和内分泌干扰作用表现为改变了雄性斑马鱼生殖行为和HPGL轴上基因表达水平；性腺基因与大脑和肝脏基因相比对PFOS产生的毒作用更敏感。2.雌性斑马鱼在上午八点比晚上七点产力更强；其在上午八点对PFOS暴露引起的生殖及内分泌毒性作用效应及相关基因表达更加明显；不同暴露时间会影响经不同浓度PFOS染毒后基因表达的敏感性。
3.PFOS对不同性别成年斑马鱼的毒性作用有差别，可根据雌鱼雄鱼不同特征有针对性地选取合适的参数进行描述。
4.经PFOS暴露后，斑马鱼生殖内分泌相关指标均发生变化。从基因、激素以及表型等不同层面分析PFOS对斑马鱼的影响，并探索它们之间的相互作用规律，有助于系统性地阐述PFOS对成年斑马鱼的毒作用机制。
5.激素分泌具有节律性，参照性激素的分泌特征选取恰当的时间点研究PFOS对斑马鱼生殖内分泌相关基因、激素以及表型的改变，才能更完整准确地阐明其毒性作用。