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目的:
获得乳房外pagets病(extramammary pagets disease,EMPD)特征性miRNA表达谱分析。
方法:
通过激光捕获显微切割精确选择EMPD患者病变组织和大汗腺组织,以正常表皮为对照,裂解后提取包含miRNA的总RNA,逆转录后,使用TaqMan humanmiRNA array进行miRNA阵列分析,寻找差异表达miRNA,并选择具有代表性的单个miRNA进行实时定量PCR验证。
结果:
获得EMPD组织和周围正常表皮的miRNA表达谱。经过统计发现其中有31个miRNA存在差异表达。其中20个miRNA在pagets病肿瘤细胞和周围正常表皮中表达呈有或无,其中hsa-miR-548d-5p,hsa-miR-34c-5p,hsa-miR-589,hsa-miR-579, hsa-miR-449b, hsa-miR-492, hsa-miR-18b, hsa-miR-50i-5p,hsa-miR-132, hsa-miR-1225, hsa-miR-200b#, hsa-miR-938, hsa-miR-1179,hsa-miR-622,hsa-miR-135b#,hsa-miR-1270在在pagets病组织中有表达而在周围正常表皮无表达。而hsa-miR-145#,hsa-miR-193b#, hsa-miR-603和hsa-miR-548d-3p在EMPD组织中无表达而在周围正常表皮中有表达。
在阵列结果中发现有11个在pagets病肿瘤细胞和周围正常表皮中表达水平存在明显差异miRNA。其中hsa-miR-222和hsa-miR-149在pagets病肿瘤细胞中表达水平明显低于周围正常表皮,而hsa-miR-182,hsa-miR-135a,hsa-miR-652, hsa-miR-31, hsa-miR-10b, hsa-miR-375, hsa-miR-1254,hsa-miR-409-3p和hsa-miR-31#在pagets病肿瘤细胞中表达水平明显高于周围正常表皮。
在验证试验中通过对具有代表性的hsa-miR-375,hsa-miR-10b,hsa-miR-31,hsa-miR-149和hsa-miR-222进行单独做实时定量PCR。除hsa-miR-10b外上述miRNA在pagets病肿瘤细胞和周围正常表皮中表达水平均与miRNA阵列结果一致,证明了基因阵列所得数据的可靠性。
在验证实验中与同时与大汗腺表达水平做对比,得到结果是hsa-miR-31在乳房外pagets病肿瘤细胞中表达显著高于周围正常表皮和大汗腺,而大汗腺中的表达水平与正常表皮无显著差异。hsa-miR-222在正常表皮中表达水平显著高于肿瘤组和大汗腺,同时肿瘤组和大汗腺的表达无显著差异。而hsa-miR-375和hsa-miR-149在三组中表达水平相互之间均存在显著差异。而hsa-miR-10b通过验证发现其在肿瘤和周围正常皮中表达水平离散,无明显差异。
结论:
1.EMPD组织miRNA存在特异性表达,区别于周围正常表皮。
2.miR NA阵列筛选出31个差异表达的miRNA,其中hsa-miR-222在大汗腺和EMPD中表达趋势一致。hsa-miR-31在肿瘤组织表达水平中明显高于正常组织。