生物恐怖由来已久,在伊拉克生物武器核查和美国“9.11”炭疽芽孢恐怖事件后,这一问题引起了世人更广泛的关注。国际社会已经认识到生物战和生物恐怖威胁的现实性,反生物恐怖已经成为国际反恐斗争中一个重要组成部分。应对生物恐怖威胁的先决条件之一就是要对生物恐怖相关病原进行快速、准确的检测。建立一些能同时检测多个生物恐怖剂的方法,辅以控制假阳性和假阴性结果的手段,可以达到快速确定病原的目的,能为积极有效地实施生物恐怖防御奠定坚实的基础。利用基因芯片技术实现细菌通用检测鉴定一直是国内外微生物学家研究的重要领域,本实验室在这一方面也做出了一些的努力。细菌通用检测芯片最常用的策略是利用细菌中保守的16S rRNA基因或23S rRNA基因,设计通用的扩增引物和各细菌特异的寡核苷酸探针,将寡核苷酸探针固定在芯片上,用通用引物扩增待检标本并进行标记,与芯片杂交,根据杂交信号进行判断。但是在实践过程中,我们发现,由于种种原因,所设计的一些寡核苷酸探针特异性并不理想,有比较严重的交叉反应现象,检测的特异性有待提高。而对于一些生物战剂而言,这一问题变得尤为严重,例如炭疽芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌的16S rRNA基因序列几乎完全一致,而鼠疫耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌的16S rRNA基因及23S rRNA基因序列几乎完全一致,这就给细菌性生物战剂的基因芯片检测提出了严峻的挑战。对于细菌战剂的检测,目前最灵敏而特异的方法是,针对每种战剂选择特异的基因设计引物,进行PCR检测。在这一方面,本实验室也展开了大量工作,积累了一定的经验。但初期建立的方法只能针对每一生物恐怖剂进行“一对一”的检测。结合本实验室在DNA芯片以及生物恐怖剂PCR检测方面的经验,我们设想,在一个PCR体系中加入多对针对不同战剂的引物,首先进行多重PCR(Multiplex PCR)扩增和标记,再进行芯片杂交,有望实现多种生物恐怖剂的同时检测。目的和意义:建立特异基因多重PCR-DNA芯片检测重要细菌性生物恐怖剂的方法。这一技术结合了PCR方法的灵敏度和特异性,以及DNA芯片技术的高通量特点,可以避免以往多重PCR检测中可能出现的非特异结果,也能减少基于保守基因扩增和杂交的基因芯片技术中经常出现的交叉反应,达到“一次反应检测多种生物恐怖剂”的目的。实验方法:针对八种细菌性生物恐怖剂(炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌、土拉弗朗西斯氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、普氏立克次体、立氏立克次体和伯氏考克斯氏体),每种目标细菌选择两个特异基因设计引物,将特异PCR产物点制DNA芯片,建立多重PCR反应体系,用Cy5荧光标记的多重PCR产物与芯片杂交;进而通过特异性实验、灵敏度的评价、多种靶细菌同时检测、动物感染标本检测、杂菌干扰实验和混合样品的盲测实验等进行系统评价。实验结果:1.结合特异基因多重PCR和DNA芯片技术,建立了一种简便快速,检测多种细菌性生物战剂的通用检测方法。我们选择了醛基化片基,采用机器点样模式制备芯片;为了得到良好的特异性,使用了65℃的较高温度杂交;杂交时间为45min。从样品处理、多重PCR、芯片杂交到得出分析结果,约需3小时左右。2.将八种细菌战剂的十六条特异引物分成三组“Cocktail”组合,建立了三个多重PCR的扩增体系,进行八种靶细菌十六个特异基因的同时检测。针对单一目标细菌进行的试验表明,DNA芯片相应的预期位置皆可产生明确的杂交信号,背景清晰,无非特异信号。本系统所使用的引物和探针能实现对八种目标生物恐怖剂的有效检测。3.随机选择了三种临床常见病原菌,白喉棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门菌的DNA作为模板,进行三组多重PCR扩增标记,分别进行DNA芯片杂交,均没有出现任何杂交信号。表明本系统具有较好的特异性。4.选择与鼠疫耶尔森氏菌和炭疽芽孢杆菌极其近缘的假结核耶尔森氏菌和枯草芽孢杆菌进行进一步的特异性评价。结果显示,近缘细菌没有出现任何杂交信号,说明本系统可以有效区分鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌及其近缘细菌。5.以鼠疫耶尔森氏菌(EV76)和炭疽芽孢杆菌(A16R)作为模板,评价了本系统的灵敏度。细菌菌液系列稀释试验表明,本系统针对鼠疫耶尔森氏菌(EV76),最低可以检测到11个细胞,血液模拟标本能得到110个细胞;针对炭疽芽孢杆菌(A16R),最低可以检测到14个细胞;血液模拟标本能得到140个细胞。本系统检测比传统PCR灵敏10倍,具有比较理想的灵敏度。6.分别混合2、3、4、5、6和8种目标细菌的核酸模板,使用本系统进行检测,各个杂交结果均有多组探针出现阳性信号,且杂交信号与期望模式完全吻合,说明本技术能够同时检测多种生物恐怖相关病原细菌。7.制备6份盲测标本(含阴性、单一细菌以及多种细菌混合标本),进行多重PCR和DNA芯片检测。实验结果表明,样品检测准确率为100%,说明本系统能检测样品中可能含有的多种细菌性生物恐怖剂。8.动物感染标本实验中,以鼠疫耶尔森氏菌(201菌株)感染小白鼠为例,解剖后取肝、脾、肺提取DNA,进行检测,能获得明确的阳性检测结果。说明本系统具备从动物感染标本中检测目标病原的能力。9.以鼠疫耶尔森氏菌为例进行的杂菌干扰实验表明,即使在10000倍无关细菌(大肠杆菌)的干扰之下,本系统仍可实现对目标细菌(鼠疫耶尔森氏菌)的准确检测。实验结论:本研究建立的多重PCR-DNA芯片系统可以稳定而特异地实现多种细菌性生物恐怖剂的通用检测,具有简便、快捷,良好的特异性和高度敏感性。本系统具备检测动物感染标本以及严重污染标本的能力,为防范生物恐怖袭击、应对紧急疫情的发生、动态的疫源地疫情监测提供了快速检测鉴定的有力手段,具有良好的应用前景。本方法也可应用到病毒以及真菌等病原体的通用检测中。