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目的：
分离培养人脐带间质干细胞(human umbilical cordmesenchyrmal stem cells,hucMSCs),建立hucMSCs来源的外切体(hucMSCs-exosomes)分离纯化方法,鉴定并初步分析其生物学特性;体外研究hucMSCs-exosomes对正常细胞的生长及氧化应激导致的细胞损伤的作用。
方法:采用脐带组织块贴壁培养法培养hucMSCs;利用超滤及密度梯度离心法从hucMSCs的条件培养上清中分离并纯化hucMSCs-exosomes,通过透射电镜进行形态学观察及Western blotting检测exosomes表面相关标志蛋白CD9、CD81,通过蛋白质双向电泳进一步分析其蛋白构成;将分离纯化的hucMSCs-exosomes体外分别应用于正常/过氧化氢损伤的大鼠心肌细胞(H9C2(2-1))、人肝细胞(HL-7702)、大鼠肾上皮细胞(NRK-52E)这三种细胞株,观察hucMSCs-exosomes在体外对正常细胞的生长及氧化应激导致的细胞损伤的干预作用;综合运用MTT、免疫组织化学等技术检测hucMSCs-exosomes对正常细胞的促增殖作用及对氧化应激导致的细胞损伤的预防效果;运用免疫荧光、Westem blotting、Luminex等技术寻找hucMSCs-exosomes影响细胞生长的可能机制。
结果:采用超滤及密度梯度离心法成功分离纯化得到hucMSCs分泌的exosomes。透射电镜下观察,hucMSCs-exosomes呈椭圆或碟形的囊泡状结构,直径约为40nm～100nm。hucMSCs-exosomes含有多种蛋白,并在不同的保存条件下有一定的稳定性:蛋白质双向电泳的结果进一步显示人脐带来源的exosomcs和人肺成纤维细胞来源的exosomes具有大量差异性表达的蛋白;Western blotting显示exosomes表达标记蛋白CD9、CD81。hucMSCs-exosomes对正常培养的H9C2(2-1)、HL-7702、NRK-52E细胞株通过激活ERK1/2起到促增殖作用。对过氧化氢损伤的H9C2(2-1)、HL-7702、NRK-52E,则可在一定程度上逆转细胞损伤,这可能通过活化MAPK通路中p38而起到抗凋亡作用。
结论:采用超滤及密度梯度离心法可以成功从人脐带间质干细胞的条件培养上清中分离纯化得到exosomes。hucMSCs来源的exosomes在体外能够通过活化ERK1/2促进细胞增殖,通过活化MAPK通路中p38起到抗凋亡作用。本研究可为进一步开展hucMSCs通过分泌具有活性作用的exosomes来促进组织损伤修复的相关机制研究提供实验基础,也为hucMSCs来源的exosomes作为一种新的非细胞载体的治疗方式提供实验依据。