【摘 要】
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[目的]目前树鼩成为研究人类疾病的潜在动物模型,但缺乏相应的体液免疫检测手段,并且树鼩IgE重组抗体转染表达后表达量较少无法纯化。因此可以选择DNA免疫法简单快捷的制备出树鼩IgE二抗,省略纯化抗体的步骤,直接进行DNA免疫,制备出树鼩二抗。为今后树鼩动物模型在体液免疫水平检测方面提供相应的检测手段。DNA免疫中的基因枪技术具有的快捷、高效的特点。并且利用DNA免疫技术可以更加方便我们对于不同长度
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[目的]目前树鼩成为研究人类疾病的潜在动物模型,但缺乏相应的体液免疫检测手段,并且树鼩IgE重组抗体转染表达后表达量较少无法纯化。因此可以选择DNA免疫法简单快捷的制备出树鼩IgE二抗,省略纯化抗体的步骤,直接进行DNA免疫,制备出树鼩二抗。为今后树鼩动物模型在体液免疫水平检测方面提供相应的检测手段。DNA免疫中的基因枪技术具有的快捷、高效的特点。并且利用DNA免疫技术可以更加方便我们对于不同长度的表达新冠刺突蛋白质粒DNA在实验动物体内的免疫原性进行评价。[方法]利用重组DNA技术对抗体的基因进行重组;将目的基因克隆到表达载体上,转染进入HEK293T细胞表达出重组树鼩IgE抗体,经WB检验其蛋白表达情况,通过基因枪辅助的DNA免疫法（使用BIORAD Helios Gene Gun）进行免疫雌性体重在2-2.5kg的日本大耳白兔,DNA量为1μg/发子弹,第一次与第二次免疫每次10颗子弹,第三次免疫20颗子弹,三次免疫后分别采集免疫动物血清,进行检测。简单快捷的制备出树鼩二抗。在第二部分中使用Helios Gene Gun进行免疫,免疫不同长度的表达新型冠状病毒刺突蛋白的质粒,DNA量为5μg/发子弹。每只树鼩每次基因枪免疫1发子弹,免疫部位为树鼩后腿,每只腿免疫1枪。每隔2周免疫一次,共免疫3次,在每次免疫前和第3次免疫后2周采血分离血清,用于检测血清中的IgG抗体和中和抗体。[结果]成功构建出含有树鼩IgE基因的质粒,将质粒转染进HEK293T细胞中成功表达出树鼩重组IgE抗体,但是表达量不高,且无法纯化出树鼩重组IgE抗体。所以使用基因枪辅助的DNA免疫法,使用将质粒直接包被成含有金颗粒的基因枪子弹,直接免疫雌性、体重在2-2.5kg的日本大耳白兔,免疫兔子后基因枪攻击处会形成黄褐色斑点。第三次免疫后将兔血清使用PBST 1:500稀释后检测到了树鼩重组IgE抗体,并与树鼩重组IgM、IgA抗体之间并没有交叉反应。同时在第二部分中利用基因枪对树鼩免疫不同长度的表达新型冠状病毒刺突蛋白的质粒后,在血清中检测到了抗冠S1蛋白的IgG抗体。在第一次免疫后没有明显的抗体反应,第二次免疫后有接近一半的树鼩产生了抗体反应,三免以后,全长S蛋白组的全部树鼩均产生了抗新冠S1 IgG抗体阳性。中和抗体的检测结果显示在第一次免疫后没有明显的中和抗体,第二次免疫树鼩体内开始产生了中和抗体,三免以后,全部树鼩均产生了抗SARS-CoV-2中和抗体。[结论]基因枪辅助的DNA免疫法可以在第三次免疫后得到树鼩二抗。通过利用DNA免疫的方式,可以快速对不同的新型冠状病毒刺突蛋白序列进行免疫原性评价,从而为相关新冠疫苗的研发提供免疫参考数据。
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