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大白菜(Brassica rapa.pekinensis)是一种重要的蔬菜作物,在生产上,“未熟抽薹”是造成大白菜产量和品质损失的一大难题。而从营养生长向生殖生长转换过程中,大白菜需要经历20-50天的低温环境(10℃以下),这个过程叫春化。在拟南芥中,FLOWER LOCUS C(FLC)作为一种重要的开花抑制蛋白感应春化作用,在春化中FLC受到表观遗传上的抑制。近年来的研究发现,拟南芥植株体内存在一种非编码的FLC反向转录本(NATS),它参与了FLC的表观遗传抑制。大白菜基因组上有四个FLC同源基因:BrFLC1,BrFLC2,BrFLC3,BrFLC5。其中BrFLC2的反向转录本序列已在NCBI上公布。把BrFLC2命名为BrpFLC,研究非编码RNA(反向转录本及启动子区域的短RNA)如何调控春化中BrpFLC的表观遗传抑制。
对早抽薹基因型Bre和晚抽薹基因型Da散叶的幼苗分别进行低温春化处理中,早抽薹基因型Bre的叶子低温处理诱导BrpFLC的反向转录本(BrpFLCas)表达,同时抑制正向转录本的表达。随着低温春化时间的延长,BrpFLCas表达水平升高然后降低。当低温春化3周时,也就是春化作用已经完成时,BrpFLCas和正向转录本的表达都被抑制。在晚抽薹基因型Da散叶中,春化作用需要9周的时间,在春化中,BrpFLC正反向转录本的变化趋势一致,但在Da散叶中,BrpFLC正向转录本的降低速度较慢,在春化10天时,Bre叶片中BrpFLC正向转录本已基本被抑制,而在Da散叶中需要低温处理35天才能抑制BrpFLC正向转录本。早抽薹基因型Bre和晚抽薹基因型Da散叶中BrpFLC基因序列完全一致。上述结果表明,造成早抽薹和晚抽薹的原因不在于BrpFLC基因本身,而在于BrpFLC基因表达时间的调控。
为了全面了解BrpFLC基因与其反向转录本BrpFLCas之间的因果关系,构建了35s表达不同长度和方向的BrpFLC基因组DNA片段的植物基因表达载体,转化拟南芥野生型和与FLC相关基因的突变体。在拟南芥转基因植株中,利用大白菜和拟南芥FLC的DNA序列的差异,通过RT-PCR,检测BrpFLC正,反向转录本的表达。结果表明BrpFLC3’端109bp为反向转录本的启动子,当BrpFLC基因组DNA片段包含109bp时,转基因拟南芥在低温下会表达BrpFLC反向转录本。在拟南芥中过量表达颠倒的BrpFLC基因组DNA片段,最初的目的是过量表达反向转录本,但当DNA片段包括正向转录本的内源启动子374bp时,BrpFLC反向转录本无法被表达,去除正向转录本启动子后,BrpFLC反向转录本才表达。这些结果证明了正反向转录本之间的协调关系。我们又把35s过量表达正向的包括正,反向转录本启动子的BrpFLC基因组DNA片段的载体转到需要春化的拟南芥C24,及参与FLC表观遗传抑制的基因(SDG8)的拟南芥突变体中,在转基因拟南芥中研究BrpFLC正,反向转录本的表达。以上结果表明:BrpFLCas的表达依赖于BrpFLC正向转录本的高表达,但是对BrpFLC基因的表达又有抑制作用。BrpFLC基因和BrpFLCas组成一个控制春化作用和开花时间的开花的开关。当BrpFLCas表达水平升高或BrpFLC基因表达水平降低,植株的春化时间缩短。
Northern bloting的检测结果表明,在BrpFLC基因3’端下游有100-200nt的短片段RNA,它在春化末期的叶片,及花和果荚中表达较高。由于它产生的位置位于反向转录本的启动子区域,所以推测其可能是类似动物中报道的promoter-associated short RNAs。在动物中的研究表明promoter-associated shortRNAs可以结合PRC2复合体中的SUZ12蛋白,从而介导组蛋白H3K27me3的甲基化。猜测BrpFLC3’端的短RNA有可能也结合SUZ12的同源蛋白VRN2,染色体共沉淀证明了在春化过程中BrpFLC基因内部区域存在组蛋白H3K27me3甲基化,而3’端短RNA也在春化中表达。这样,BrpFLC基因的两个非编码RNA(天然反向转录本和3’端的短RNA)共同参与了春化中BrpFLC的表观遗传抑制,反向转录本对春化初期BrpFLC表观遗传抑制的起始起作用,而3’端的短RNA参与了BrpFLC春化结束后表观遗传抑制的维持。