环氧和酶-2(Epoxy and enzyme -2, COX-2)是炎症过程中一个重要的诱导酶,正常情况下多不表达,缺氧,生长因子,炎症介质,肿瘤诱导剂及癌基因等可诱导下产生。COX-2促血管生成与其催化花生四烯酸生成的前列腺素诱导组织生成血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)有关,VEGF特异性地直接作用于内皮细胞表面受体,促进血管生成。同时,VEGF对COX-2也有诱导作用,VEGF和COX-2相互上调表达,形成一个能放大且延续反应的复杂的调节通路,进而促进血管生成。角膜移植后,由于创伤和炎性介质的刺激,促进了COX-2的生成,诱导VEGF的上调表达,促进新生血管的生成。而新生血管的生成是导致角膜移植手术失败的重要因素。塞来昔布作为一种高选择性的COX-2抑制剂,通过抑制COX-2,能够抑制VEGF的表达。PLGA是一种生物可降解的合成高分子材料,其质量稳定,生物相容性好,生物降解速度可控且降解产物毒性低和良好的可塑性等优点,广泛的用做缓控释系统的骨架材料,被美国FDA批准可用于临床,已有部分以其为载体的药品上市。目前,有许多关于塞来昔布抑制新生血管的实验报道。无论新生血管是在肿瘤还是在眼部等组织,塞来昔布都能较好的抑制其生长。在验证塞来昔布抑制角膜新生血管的实验中,多用全身给药和局部滴眼或注射溶液的方式,这些方式或是药物难以进入眼组织,或是操作繁琐效率低下,或是会对眼组织造成损害。美国的Surya等围绕塞来昔布PLGA微球在糖尿病诱导的视网膜损伤中的作用进行了一系列研究。他们发现,口服一定量的塞来昔布能够抑制糖尿病模型大鼠视网膜上的血管内皮生长因子,而结膜下注射给药后大鼠视网膜上的药物浓度是口服给药的54倍。与粒径更小的毫微粒相比,微球能更好的滞留在注射部位并且缓释时间更长。塞来昔布PLGA微球在糖尿病大鼠视网膜能够维持较高浓度,15天时溶液组已无法检测出药物,而微球组却仍维持有效浓度。通过细胞实验证实,塞来昔布微球能很好的抑制血管内皮生长因子,一次给药后可以长时间维持药物浓度。大鼠结膜下注射后,微球对动物体重、血糖水平、血细胞数目和性质,都没有影响；对视网膜和其他眼周组织也没产生病理性损伤,说明塞来昔布PLGA微球具有较高的安全性。Surya等人研究的是塞来昔布微球在糖尿病诱导的视网膜损伤模型中的药效和组织分布情况,而在角膜移植手术后,由于病理环境的不同,此时塞来昔布微球能否在眼前部维持有效药物浓度,对角膜新生血管有无抑制作用及药物的组织分布情况还有待证实。目前,很少见相关报道。PLGA微球作为缓释制剂,相对系统给药,一次给药就可以长时间维持浓度,减少了给药次数,提高顺应性,同时避免药峰谷现象,有利于降低药物的毒副作用,能够满足长期用药的需要。本课题在前人研究的基础上,结合临床情况选用另一种PLGA载体,验证塞来昔布PLGA微球在角膜移植后的眼组织分布情况和对角膜新生血管的作用,希望对临床上解决这一难题有所帮助。方法与结果采用乳化溶剂挥发法制备塞来昔布PLGA微球,以微球的粒径、包封率和载药量为指标,对制备微球的质量进行考察,体外释放实验观察微球在体外的缓释效果。以包封率为主要考察指标,按L9(34)正交表设计安排试验,对微球制备工艺进行优化。比较各因素极差R的大小确定影响工艺的因素顺序,并从各水平K值的大小上确定最佳工艺处方。结果是制备的塞来昔布PLGA微球平均粒径为(1.5±0.2)μm,载药量为(8.7±0.3)%,包封率为(94.9±0.2)%。体外释放符合Weibull方程,40天累积释放69.1%。众多影响因素的主次顺序是：搅拌时间>有机相水相之比>PVA浓度>投药比；最佳处方条件,是有机相和水相比为1：10,投药比为1：10,PVA浓度为2%,乳化搅拌时间为2 min。按最佳处方制备微球后,用于大鼠,观察药物在大鼠组织的分布情况。建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,模型建好后于结膜下注射塞来昔布PLGA微球或塞来昔布溶液,在给药后的1,7,15,30天取角膜,房水和结膜。各组织经处理后HPLC检测塞来昔布的浓度。用析因方差分析各组织与各时间点的主效应和交互效应分析；对各组采用单向方差分析进行单独效用分析。在结膜下注射两组制剂后,对于微球组,各组织和不同时间点存在主效应(各组织内主效应为F=783.8,P<0.001；各时间点的主效应为F=110.4,P<0.001),组织间和不同时间之间有交互效应(F=109.9,P<0.001)。进一步分析单独效应,在相同观察时间,结膜,房水和角膜浓度有显著性差异(P均<0.001)；各组织在不同时间点的浓度有显著性差异(P均<0.001)；多重比较各时间点间有显著性差异(P均<0.001),结膜和角膜,房水间浓度有显著性差异(P均<0.001),角膜和房水间浓度差异不显著(P=0.959)。给药后,溶液组在各组织的浓度迅速减少,在第15天时,各组织的药物浓度均在检测限以下。经两独立样本t检验,第1天溶液组和微球组在结膜处的浓度没有统计学差异(P>0.05),而在房水和角膜的浓度有显著差异(P<0.05),溶液组分别是微球组的3.9和1.3倍。第7天溶液组在结膜、房水和角膜的浓度迅速下降,和微球组相比有显著差异(P<0.05),微球组各组织浓度分别是溶液组的158.9,43.1和12.6倍。第15天以后溶液组的浓度无法测出,而微球组仍保持较高的浓度。通过和空白PLGA微球的比较,观察塞来昔布PLGA微球对新生血管的抑制作用效果。分别采用裂隙灯显微镜观测,角膜病理切片染色观测和ELISA检测角膜中前列腺素-2(Prostaglandin-2, PGE2)和VEGF含量三种方式评价塞来昔布PLGA微球对角膜新生血管的抑制作用。使用析因方差分析角膜新生血管面积,塞来昔布微球组和空白微球组不同时间点的角膜PGE2和VEGF含量的主效应和交互效应分析。结果是使用裂隙灯显微镜观测,不同药物组间新生血管面积无显著差异(F=2.38,P<0.149)；给药后不同观察时间点新生血管面积有显著差异(F=10.43,P=0.002)；药物组和不同观察时间点间无交互效应(F=0.375,P=0.695)。进一步分析各组间单独效应,结果表明,微球组在不同观察时间点间角膜新生血管面积有显著差异(F=7.58,P=0.023)；空白组在不同观察时间无显著差异(F=3.47,P=0.1)。多重比较7天和15天,15天和30天血管面积间差异有显著性。病理切片观察,7天时两组角膜基质全层分布大量新生血管,并有大量炎性细胞浸润。空白组相对治疗组全层基质中血管分布更均匀,微球组血管少且主要集中在近上皮层基质中,内皮侧半层基质血管明显较少。15天时基质中新生血管较7天时明显减少,微球组中许多血管腔隙闭合,血管退化,炎性细胞浸润减少,内皮侧基质恢复紧致结构。30天时两组角膜新生血管都进一步退化,微球组角膜基质中仅见少量炎性细胞,其中有少量几乎完全退化的血管腔隙；而空白组上皮下基质胶原纤维机化,血管腔隙不可见,仍可见少量血管腔隙纵切面。ELISA检测结果显示,微球组和空白组角膜PGE2和VEGF含量有显著性差异；但不同观察点间角膜PGE2和VEGF含量无显著性差异。各观察时间内微球组和空白组角膜PGE2和VEGF含量比较差异均有显著性。结论本研究制备的塞来昔布PLGA微球大小合适,电镜下观察为圆形,表面光滑,载药量包封率较好。体外释放符合Weibull方程,在体外有较好的缓释性。动物体内实验表明,塞来昔布PLGA微球相对于塞来昔布溶液在大鼠眼周能较长时间的维持药物浓度。通过和空白PLGA微球的比较,可以认为塞来昔布PLGA微球对角膜新生血管有抑制作用。在细胞因子水平,塞来昔布PLGA微球能减少角膜移植后角膜中PGE2的合成,从而导致VEGF含量减少,最终使角膜新生血管生成减少。