本研究将兔骨髓间充质干细胞体外增殖培养后，作为种子细胞种植到脱细胞兔主动脉血管支架上，从而构建组织工程血管，进而再移植到提取干细胞的兔体内，尝试一种仝新的血管代用品。 全文分为四个部分：第一部分兔MSCs体外分离、培养、鉴定及标记。 目的：建立兔骨髓间质干细胞(rMSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定、标记的方法，为rMSCs进一步作为种子细胞参与体外构建组织工程血管奠定基础。 方法：抽取兔髂后上棘、髂前上棘骨髓，密度梯度离心，淋巴细胞分离液ficoll分离骨髓，得到骨髓单个核细胞悬液，接种后形成单层贴壁细胞，铺满培养瓶底部后，胰蛋白酶消化传代培养扩增，倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。取生长良好的第2～10代细胞消化制备单细胞悬液，计数，绘制生长曲线。通过流式细胞分析和扫描、透射电镜鉴定细胞。溴脱氧尿嘧啶(5—brom-2—deoxyuri—dine，BrdU)与rMSCs共同培养，免疫荧光组织化学法和流式细胞仪法对rMSCs的表面标记进行检测，同时检测第3代和同代BrdU标记的rMSCs及第10代rMSCs的细胞周期。 结果：原代细胞接利24h，培养瓶底开始出现较多圆形单个核细胞贴壁，培养3～4d，可见细胞开始呈集落生长，单个牛长的细胞由圆形向短梭彤或多角形转化，集落逐渐增大，呈漩涡状排列。P0代培养约2w后，单个核细胞融合，铺满培养瓶底。传代后的细胞很快贴壁，增殖迅速，细胞均匀分布，无集落形成，生长均匀一致。随着传代次数增多，rMSCs牛长速度逐渐减慢，第10代以后更为明显，死亡细胞增多。从rMSCs传代细胞生长曲线可以看出：(1)传代培养潜伏期约为24～48h；(2)对数增殖期约在第5d；(3)第8d左右细胞生长逐渐缓慢，进入平台期。流式细胞仪检测发现细胞膜表面CD45—FITC、CD14-PE、CD34-PE、HLA—DR—PE检测均为阴性，CD29-FITC、CD44-FITC、CD105—PE检测均为阳性。扫描、透射电镜发现细胞表面许多短而粗的微绒毛突起，胞浆内有丰富的线粒体和粗面内质网，并可见分泌小泡，核大，形态不规则，异染色质少，常染色质丰富。细胞周期分析示，BrdU标记的rMSCs形态及增殖速度与未标记的rMSCs无明显改变，细胞周期也无明显改变。第3代rMSCs中G0/G1期的细胞为90.54％，第10代中为78.62％，BrdU标记的rMSCs为88.49％。而第3代和第10代rMSCs，处于G0/G1期的细胞数有明显差异，随着传代次数的增多，处于静止期的细胞减少，增殖能力减弱。 结论：密度梯度离心结合贴壁分离培养法，以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs，分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性，而且体外增殖活跃。BrdU标记对细胞形态、增殖速度及细胞周期影响不大，可以用来作为标记细胞的一种有效手段。 第二部分兔腹主动脉脱细胞血管支架的制备及MHCI抗原检测。 目的：探讨组织工程血管脱细胞血管支架的制备及其免疫原性的检测方法。 方法：取新西兰大白兔腹主动脉，剪成1.0cm长的血管段，随机分为3组(每组5段)：对照组1、对照组2、脱细胞组。对照组1：TBS冲洗后直接用Bouin液固定12h，石蜡包埋。对照组2：TBS 4℃浸2h，1％TritonX-1004℃持续震荡12h。脱细胞组：TBS4℃浸2h，1％TritonX-1004℃持续震荡12h，0.125％胰酶37℃消化12h，按1：1比例用0.5mg/ml DNA酶和0.5mg/ml RNA酶37℃消化12h，TBS洗3次。行HE、Masson、VG染色，光镜及扫描、透射电镜观察血管内皮细胞、平滑肌细胞的脱落情况，以及血管弹力纤维、胶原纤维连续性是否完好，有无中断、消失，胶原纤维横纹是否消失，有无细胞结构或细胞碎片残留。免疫组化方法检测血管脱细胞处理前后主要组织相容性复合体I(MHCI)的变化情况，并将检测结果作图像分析。 结论：通过TritonX-100、胰酶以及DNA酶、RNA酶可以在体外制备脱细胞血管支架。MHCI免疫组化染色能很好地反映血管脱细胞处理前后免疫原性强弱变化，可作为检测血管脱细胞支架免疫原性的实验方法之一。 第三部分 rMSCs种植脱细胞血管支架构建组织工程血管的实验研究。 目的：探讨骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管支架体外构建组织工程血管的可行性。 方法：通过TritonX-100、胰酶以及DNA酶、RNA酶将兔腹主动脉制备成脱细胞血管支架。将培养的2～5代兔rMSCs用0.125％胰酶消化，收集细胞，BrdU标记，DMEM培养液制成细胞悬液，细胞密度调整至5×105/ml。实验组：将兔脱细胞血管支架置于培养管中，加入rMSCs细胞悬液，37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养。每4h翻转90°，隔天换培养液。对照组：兔脱细胞血管支架置于培养管中，不加入rMSCs细胞，在同样条件下培养。分别在血管培养2、4、6、8、12、14、28d时，各取一小段血管(0.2～0.5cm)，光镜、电镜观察rMSCs在脱细胞支架上的黏附及生长情况。激光共聚焦荧光显微镜下观察实验组、对照组血管组织切片能否见到BrdU染色阳性(核发绿色荧光)细胞黏附及生长。取组织工程血管组、脱细胞血管支架组及新鲜兔腹主动脉组血管，分别裁剪成1.0cm×0.5cm大小相同的血管条，用生物力学测定仪给予单轴负荷，检测其在不同径向应力下的应变情况，并绘制径向应力应变曲线；同时，取长为1.0cm的各组血管，利用生物力学测定仪给予纵向拉力直到血管断裂，测定最大断裂强度。 结论：兔骨髓问充质干细胞复合脱细胞血管支架可于体外成功构建组织工程血管，而且与兔自身动脉有着极其相似的顺应性，有望成为一种全新的血管代用品。 第四部分组织工程血管兔腹主动脉置换的实验研究。 目的：建立腹主动脉移植的动物模型，观察rMSCs复合脱细胞血管支架构建的组织工程血管在移植后的组织形态学变化、内皮细胞覆盖情况及免疫原性。 方法：体外将BrdU标记的rMSCs与兔腹主动脉脱细胞支架共同培养构建组织工程血管。以新西兰大白兔为研究对象，按无菌原则及非接触技术横断肾下腹主动脉，剪下一段腹主动脉长约1.0cm，再将供体血管以8/0国产聚丙烯线间置吻合到腹主动脉上。实验分组：A组，新鲜移植组(对照组1)，移植30段新鲜同种异体血管；B组，脱细胞血管支架组(对照组2)，移植30段经过脱细胞处理的兔腹主动脉血管；C组，组织工程血管组(实验组)，移植30段rMSCs复合兔腹主动脉脱细胞支架体外构建的组织工程血管，其中受体为抽取rMSCs的实验兔。术后1，3，7，14，30，60d(n=4)，观察移植段腹主动脉的通畅情况，光镜观察血管内膜、弹力纤维、胶原纤维，扫描电镜观察动脉内表面及细胞间联系等。BrdU及Ⅷ因子相关抗原的免疫荧光染色：一抗均为鼠单克隆抗体，对于二抗，BrdU选用FITC(发绿色荧光)标记的羊抗鼠IgG，工作浓度1：1000；Ⅷ因子相关抗原选用TRITC(发红色荧光)标记的羊抗鼠IgG，工作浓度1：100，激光共聚焦荧光显微镜观察血管内膜。流式细胞仪测定兔血管移植术后T细胞亚群CD4+、CD8+以及T细胞受体TCRαβ随时间的改变。 结果：B组及C组的通畅率为91.6％及95.8％，而A组的通畅率仅有62.5％。术后30d：A组血管内壁租糙，内皮细胞脱落，局部血栓形成并机化，炎性细胞附着。B组及C组血管内表面被膜样物质覆盖，局部可见内皮细胞，但内皮细胞排列凌乱，形状欠规则。术后60d：A组内壁粗糙，附壁血栓机化，内膜不完整；B组内皮细胞增多，但仍不能完全覆盖血管内表面；C组完全被内皮细胞覆盖，内皮细胞表面有微绒毛。激光共聚焦荧光显微镜下观察：A组血管内表面一直未见BrdU染色阳性细胞；FⅧ阳性细胞为内皮细胞，细胞浆发红色荧光，术后随着时间延长逐渐减少。B组内表面亦未见BrdU染色阳性细胞，术后4w FⅧ阳性细胞散在分布，8w FⅧ阳性细胞较多，但仍不能完全覆盖血管内表面。而C组一直有BrdU染色阳性细胞，核发绿色荧光，3d后BrdU染色阳性细胞稍有减少：2w后出现FⅧ阳性细胞散在分布，但BrdU染色阴性；4w后FⅧ阳性细胞增多，部分FⅧ阳性细胞同时表现BrdU染色阳性：8w后FⅧ阳性细胞基本完全覆盖血管内表面。A组、B组和C组术后CD4+T细胞均增多，4w时达到最高，并持续高表达。CD8+T细胞数量减少，CD4+/CD8+比值在4w时达到最高，而且T细胞表面的受体TCRαβ也在术后快速上调，变化趋势同CD4+/CD8+，A、B及A、C组间有显著性差异(n=4，P＜0.05)，而B、C组间无显著性差异(n=4，P＞0.05)。 结论：脱细胞支架组及组织工程血管组引起宿主的细胞免疫反应远低于新鲜移植组，术后通畅率高。rMSCs在兔体内局部微环境的诱导下可以分化为内皮细胞。可以将受体MSCs在体外种植到同种异体脱细胞血管支架上，构建组织工程血管，再移植到受体需要血管重建的部位，以克服目前血管代用品通畅率低下的缺点。