论文部分内容阅读
目的:基于代谢组学和网络药理学的研究方法,系统的分析左、右归丸辨证治疗卵巢储备功能减退的代谢物质基础和相关的代谢通路,并进一步探索其治疗作用机制,为中医辨证论治卵巢储备功能减退提供科学基础。方法:1、多中心医院门诊收集卵巢储备功能减退肾阴虚证患者,给予左归丸治疗12周;卵巢储备功能减退肾阳虚证患者,给予右归丸治疗12周,基于非靶向代谢组学研究技术,分别对健康人和左归丸治疗卵巢储备功能减退肾阴虚证前后、健康人和右归丸治疗卵巢储备功能减退肾阳虚证前后进行血清代谢物分析,筛选出左归丸治疗卵巢储备功能减退肾阴虚证和右归丸治疗卵巢储备功能减退肾阳虚证的潜在生物标志物,并对生物标志物进行代谢通路分析。分别记录和统计患者治疗后的妊娠率以及的血清激素基础水平（bFSH、bLH、bE2、AMH）、中医辨证证型评分、Kupperman评分的改变。2、进一步通过网络药理学揭示左归丸和右归丸辨证治疗卵巢储备功能减退患者可能存在的核心靶点和信号通路。通过数据库筛选左归丸和右归丸化学成分的作用靶点,并分别与卵巢储备功能减退肾阴虚证、卵巢储备功能减退肾阳虚证的疾病靶点取交集。将筛选得到的左归丸治疗卵巢储备功能减退肾阴虚证和右归丸治疗卵巢储备功能减退肾阳虚证核心靶基因（共有靶基因）导入String,获取共有靶基因的蛋白质与蛋白质相互作用关系网。将从String导出的包含作用节点关系信息的.tsv格式文件导入Cytoscape软件,并进行可视化处理,并用Net-work Analyzer和Cyto NCA插件对靶点的网络特征指标度（Degree）和介数（Betweenness）进行拓扑参数分析。利用在线分析数据库Metascape数据库对核心靶点进行GO和KEGG富集和可视化分析,并使用AutoDock Tools1.5.6将得到的左归丸和右归丸的关键有效成分和筛选出的核心靶蛋白进行分子对接验证,利用PyMol软件将结果可视化。结果:1、多中心医院门诊收集卵巢储备功能减退肾阴虚证患者23例,给予左归丸治疗12周;卵巢储备功能减退肾阳虚证患者25例,给予右归丸治疗12周。左归丸回调卵巢储备功能减退肾阴虚证患者左旋肉碱、乙酰辅酶A、辅酶A、硬脂酸油酰胺、胆固醇亚油酸、皮质醇、辅酶Q10（CoQ10）等共26种差异代谢物,共映射到12条代谢通路分别是类固醇激素生物合成、脂肪酸降解、柠檬酸循环（TCA循环）、丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、泛酸和CoA生物合成、脂肪酸伸长率、丙酸代谢、色氨酸代谢、硫胺素代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、糖酵解/糖异生;右归丸回调卵巢储备功能减退肾阳虚证患者的亚油酰胺、己二酰辅酶A、L-赖氨酸、赖氨酸精氨酸、γ-谷氨酰-β-氰基丙氨酸、苏氨酰酪氨酸、α-生育酚等22种差异代谢物,共映射到11条代谢通路分别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、赖氨酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、柠檬酸循环（TCA循环）、鞘脂代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、糖酵解/糖异生、氨酰-tRNA生物合成、硫胺素代谢、生物素代谢。卵巢储备功能减退肾阴虚证患者和卵巢储备功能减退肾阳虚证患者治疗后bFSH、bLH值均明显低于治疗前（P＜0.05）,差异有统计学意义,虽然bE2、AMH差异没有统计学意义,但有明显改善趋势。卵巢储备功能减退肾阴虚证患者和卵巢储备功能减退肾阳虚证患者经中药治疗后中医证型评分和Kupperman评分值均明显低于治疗前（P＜0.05）,差异有统计学意义。卵巢储备功能减退肾阴虚组妊娠2例,妊娠率8.7%,卵巢储备功能减退肾阳虚组妊娠1例,妊娠率4%。2、通过网络药理学研究方法鉴定出左归丸有效成分143个,预测得到作用靶点448个;右归丸有效成分159个,预测得到作用靶点420个。筛选卵巢储备功能减退肾阴虚证基因为1 13个,卵巢储备功能减退肾阳虚证基因为147个。最后获得左归丸治疗卵巢储备功能减退肾阴虚39个靶点,右归丸治疗卵巢储备功能减退肾阳虚41个靶点。左归丸通过多种活性成分作用于TP53、VEGFA、ALB等核心靶点,涉及生殖系统的发育、激素反应、对类固醇激素的反应等生物过程;细胞膜、膜筏、细胞器外膜等细胞成分;类固醇结合、蛋白激酶活性、脂质结合、ATP酶结合、磷酸转移酶活性等分子功能;PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、雌激素信号通路、细胞衰老、JAK-STAT信号通、MAPK信号通路等信号通路。右归丸通过多种活性成分作用于AKT1、TP53、VEGFA等核心靶点,涉及生殖系统发育、生殖结构发育、胚胎胎盘发育、细胞迁移的正向调节等生物过程;膜筏、质膜筏、线粒体外膜、内质网腔等细胞成分;细胞因子活性、G蛋白偶联受体结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等分子功能;PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、细胞衰老、IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等信号通路。分子对接结果显示,左归丸关键有效成分和卵巢储备功能减退肾阴虚证核心靶点、右归丸关键有效成分和卵巢储备功能减退肾阳虚证核心靶点结合能均小于0,说明两者之间能够稳定的结合。结论:本研究利用代谢组学和网络药理学方法,初步发现左归丸回调卵巢储备功能减退肾阴虚证患者、右归丸回调卵巢储备功能减退肾阳虚证患者的血清代谢物,以及可能发挥辨证论治作用的核心靶点和信号通路。这种研究方法可为探索中医辨证论治卵巢储备功能减退客观依据提供新思路。