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猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原体,猪链球菌感染不仅可导致猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎、败血症和猝死症,并可导致从业人员感染出现中毒性休综合症、脑膜炎及败血症等严重疾患。国内外的研究主要集中于S.suis 2的毒力相关因子,但也仅涉及一些功能性鉴定,新的毒力因子不断被发现并有待进一步探讨。本课题开展了猪链球菌2型(S.suis 2)05ZYH33烯醇化酶(Enolase)、Suilysin和Hemolysin的研究。1猪链球菌2型Enolase对新近测定的S.suis 2 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,设计合成引物,原核克隆表达并纯化出具有酶活性的S.suis 2 05ZYH33 Enolase。酶联免疫吸附实验和流式细胞术发现Enolase可部分存在S.suis 2 05ZYH33的表面。黏附竞争实验证实S.suis 2表面Enolase参与对宿主细胞的黏附。溶血空斑实验提示Enolase可能抑制免疫反应。PCR检测eno在S.suis各血清型中普遍存在。Westernblot表明Enolase具有较高的反应原性,由此基于Enolase建立了S.suis2 ELISA抗体检测方法。Enolase作为一个潜在的毒力因子为进一步探索S.suis 2的致病机理提供了思路。2猪链球菌2型Suilysin利用PCR技术从S.suis 2 05ZYH33基因组DNA中扩增suilysin序列,构建pET32a::suilysin原核表达质粒,转化入E.coli BL21(DE3),重组菌在37℃诱导4h时表达产物最多。以包涵体形式存在的重组蛋白经尿素溶解、His-Tag亲和层析纯化和谷胱甘肽复性后,溶血实验表明其具有溶血活性,且活性受温度、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、过氧化氢、蛋白酶K等一些理化因素的影响。免疫保护实验显示出Suilysin对Balb/c小鼠有一定的保护作用,有可能作为S.suis 2疫苗的侯选分子。3猪链球菌2型Hemolysin本实验在对S.suis 2 05ZYH33进行全基因组序列测定、ORF预测和功能注释的基础上,对05ZYH33中的05SSU1668编码基因进行系统预测和分析,发现其具有信号肽和跨膜区,主要由DUF21、CBS和CorC-HlyC三部分组成。同源性分析表明与很多菌中具有溶血活性的蛋白具有较高的相似性。由此构建了pET30a::hemolysin原核表达质粒,为深入探讨Hemolysin的溶血活性及其在S.suis 2致病中的作用奠定基础。