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目的:本实验通过复制Marmarous大鼠闭合性颅脑损伤模型,采用组织芯片技术结合免疫组化染色,研究闭合性颅脑损伤后单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)及其高亲和性受体CCR2在脑组织中的表达部位、时序特点及相互关系,以期为闭合性颅脑损伤的干预治疗提供理论和实验依据。
方法:选用雄性SD大鼠,体重350g-400g。根据随机化原则分为正常对照组、手术对照组和脑损伤后1h组、2h组、4h组、8h组、12h组、24h组、48h组、72h组和5d组。
复制Marmarous大鼠落体打击损伤模型。分别于脑损伤后不同时间进行4%多聚甲醛灌注固定、取材。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)和棓花青(Einarson)尼氏体染色法观察脑损伤病理改变。用组织芯片仪制作组织芯片,免疫组化SP法检测大脑皮质、海马和脑干神经细胞MCP-1和受体CCR2的表达情况。采用Mias2000图像分析系统采集并计算阳性细胞数,全部数据均采用SPSS11.5 for windows分析软件进行统计学处理。
结果:
1.病理学改变:
损伤组肉眼观察可见脑组织水肿、蛛网膜下腔出血及脑挫伤,并累及脑底、脑干。组织学改变主要表现为:部分神经细胞胞体固缩、深染、拉长或呈三角形;部分神经细胞胞体肿胀,胞浆变空,核淡染,核膜及核仁完整。部分脑干神经纤维增粗或呈波浪样变。 2.MCP-1免疫组织化学染色结果对照组皮质、海马、脑干部位均有少量免疫反应阳性细胞表达。阳性物质呈棕黄色,定位于细胞核。
损伤组皮质、海马、脑干部位MCP-1的免疫反应阳性细胞数目增多,免疫阳性物质增加,胶质细胞呈强阳性表达。主要位于项叶皮质受击部位,海马CA3、CA4区及齿状回的阳性表达明显,脑干免疫反应呈阳性的神经细胞和胶质细胞亦显著增加。
顶叶皮质MCP-1免疫反应阳性细胞计数于损伤后2h表达开始增多,至12h达峰值,然后逐渐降低。与对照组比较,损伤组2h-24h组差异有统计学意义(P<0.01),损伤后48h组差异有统计学意义(P<0.05),损伤后1h,72h和5d组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
海马MCP-1免疫反应阳性细胞计数于损伤后2h表达开始增多,至12h达峰值,然后逐渐降低。与对照组比较,损伤组2h-48h组差异有统计学意义(P<0.01),损伤后1h,72h和5d组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
脑干MCP-1免疫反应阳性细胞计数于损伤后2h表达开始增多,至12h达峰值,然后逐渐降低。与对照组比较,损伤组2h-24h组差异有统计学意义(P<0.01),损伤后48h组差异有统计学意义(P<0.05),1h,72h和5d组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
3.CCR2免疫组织化学染色结果对照组皮质、海马、脑干部位均有少量免疫反应阳性细胞表达。阳性物质棕黄色,定位于细胞核。
损伤组皮质、海马、脑干部位CCR2的免疫反应阳性细胞数目增多,免疫阳性物质增加,胶质细胞呈强阳性表达。主要位于顶叶皮质受击部位,海马以CA3、CA4区及齿状回表达明显,脑干免疫反应阳性的神经细胞和胶质细胞亦显著增加。
顶叶皮质CCR2免疫反应阳性细胞计数于损伤后4h表达开始增多,至24h达峰值,然后逐渐降低。与对照组比较,损伤组4h-72h组差异有统计学意义(P<0.01),损伤后1h,2h和5d组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
海马CCR2免疫反应阳性细胞计数于损伤后4h表达开始增多,至24h达峰值,然后逐渐降低。与对照组比较,损伤组4h-72h组差异有统计学意义(P<0.01),损伤后1h,2h和5d组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
脑干CCR2免疫反应阳性细胞计数于损伤后4h表达开始增多,至24h达峰值,然后逐渐降低。与对照组比较,损伤后4h组差异有统计学意义(P<0.05),损伤组8h-72h组差异有统计学意义(P<0.01)。损伤后1h,2h和5d组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。
结论:
1.正常时皮质、海马和脑干部位均有少量MCP-1免疫反应阳性细胞表达。脑损伤后皮质、海马和脑干部位的MCP-1免疫反应阳性表达增强,免疫反应阳性细胞数目增多,损伤后2h皮质、海马和脑干部位的MCP-1表达开始增强,12h达峰值,然后逐渐降低,72h基本回落至正常水平。
2.正常时皮质、海马和脑干部位均有少量CCR2免疫反应阳性细胞表达。脑损伤后皮质、海马和脑干部位的CCR2表达增强,免疫反应阳性细胞数目增多,损伤后4h皮质、海马和脑干部位的CCR2表达开始增强,24h达峰值,维持较高水平到72h,于损伤后5d基本回落至正常。
3.MCP-1及其受体CCR2在闭合性颅脑创伤早期即明显表达,达峰值后逐渐降低,MCP-1的表达峰值略先于受体CCR2表达峰值。二者在闭合性颅脑创伤后的动态表达,提示其在脑损伤病理生理进程中起着重要的调控作用。