阿魏酸酯酶(FAEs)(EC3.1.1.73)属于羧基酯酶的一个亚家族，它能够水解植物细胞壁中半纤维素中的羟基肉桂酸与阿拉伯木聚糖和某些胶质形成的酯键。阿魏酸酯酶是半纤维素完全降解的关键酶之一，被广泛应用于木质纤维素的降解、造纸工艺、食品、制药行业，用于生产阿魏酸或肉桂酸，作为抗氧化剂和芳香化合物的前体。其中，真菌来源的阿魏酸酯酶是研究和应用最广泛的。由于大多数的阿魏酸酯酶都是从中温菌中分离出来的，所以它们的耐热性很有限。　　前期实验中，我们对来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶进行改造，获得了耐热性提高的突变子。在工业生产中，使用耐热的酶可以提高反应温度，从而降低微生物污染，减少酶的投入量，增加反应灵活性。　　为了充分利用自然界酶的多样性，本研究克隆了4个来源于真菌的阿魏酸酯酶，构建了DNA家族改组文库，最终筛选到4个热稳定性提高的嵌合体。它们与耐热性最高的母本相比，热失活半衰期提高1.2至2.1倍。与我们之前识别到的黑曲霉阿魏酸酯酶耐热性有关的有益突变子相比，嵌合体中缺少2-4个已知I63T，H121Q、T163S，和C235S有益突变点。我们把这些位点进行整合，组成新的阿魏酸酯酶嵌合体Chi02-2、Chi04-2、Chi07-2和Chi10-2。其中耐热性最高的Chi07-2最适反应温度为68℃;在65℃的热失活半衰期达到了240m in，是热稳定性最高的母本的16倍;在60℃条件下水解气爆玉米秸秆释放阿魏酸的效率是其3.6倍。因此，突变的嵌合体在工业上有很大的应用潜力。　　真菌阿魏酸酯酶的Cys235与酶的热稳定性有很大联系。这一位点的自由半胱氨酸被丝氨酸取代之后，突变体在75℃处理后的残余酶活比55℃处理后的残余酶活高。我们推测突变体在75℃热处理后，可能形成对蛋白重折叠更有利的中间体，导致其在冰浴以后，恢复到与天然态类似的结构。为了进一步研究该位点，我们对来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶Cys235进行饱和突变，获得了5个有活性的突变体。我们发现，突变体有类似的非经典蛋白质失活规律。通过对母本及突变体的自由巯基和二硫键含量变化、圆二色谱、内源荧光光谱分析发现，母本在热处理后发生不可逆热失活;而突变体在高温状态下的的热失活是可逆的，且突变体的变性状态与温度息息相关，突变体在75℃处理冰浴后的构象更有利于蛋白恢复到天然状态。　　以上结果表明，235位点的自由半胱氨酸被其他氨基酸取代，降低了黑曲霉阿魏酸酯酶的不可逆热失活。本研究将为蛋白质中自由半胱氨酸被取代导致的不可逆热失活提供论据。