研究背景卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指女性在40岁前因卵泡功能障碍或卵泡耗竭而导致的卵巢功能障碍,伴有闭经、雌激素缺乏、生殖器官萎缩等临床症状。近年来发病率呈上升趋势,严重影响了女性的生育力。因其病因不明,临床仍以激素替代等治疗方式为主。目前尚无有效改善患者卵巢功能并生育遗传学子代的治疗方式,干细胞研究为POF的治疗开拓了崭新的途径。研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗后可以有效改善POF动物模型甚至部分患者的卵巢功能,但具体作用机制尚不清楚。深入探究MSCs治疗POF的相关作用机制将为其临床治疗奠定理论基础。颗粒细胞是卵巢排卵和性腺激素分泌过程中重要的功能细胞。颗粒细胞的增殖和成熟对卵泡形成和发育过程起到重要支持和调节作用,而其凋亡也是影响卵巢储备和功能下降的重要机制。多项研究表明POF模型的组织和细胞水平均存在颗粒细胞的凋亡,MSCs治疗后可以促进颗粒细胞增殖、减少凋亡。因此,颗粒细胞可能为MSCs改善POF卵巢活性和功能的靶向作用细胞。旁分泌是MSCs参与POF卵巢修复和功能改善的主要作用机制。作为旁分泌机制中的重要组成部分,外泌体通过携带和传递重要的信号分子参与细胞间的通讯和信号传导。研究表明,外泌体是一种纳米级囊泡状脂质双层膜结构,可由多种细胞分泌,且含有的蛋白质、脂质体、RNA等活性物质参与多种生物学行为。最新的研究显示,MSCs外泌体能够通过释放微小RNA(micro RNA,miRNA)抑制颗粒细胞凋亡从而改善卵巢功能。例如羊水MSCs外泌体可以通过miR10a下调凋亡蛋白的表达,从而抑制卵巢颗粒细胞凋亡、预防卵泡闭锁、恢复受损的卵巢功能。因此,外泌体携带的miRNA在MSCs介导的组织功能修复中起到关键作用。颗粒细胞凋亡受到多重信号通路调控,p53作为常见的抑癌基因,在细胞周期阻滞、细胞衰老中具有重要作用。先前研究表明,p53也是调控颗粒细胞凋亡的关键基因,可以通过调控促凋亡和抗凋亡调节因子促进凋亡相关蛋白的表达。然而p53在MSCs治疗颗粒细胞凋亡中的作用尚未完全阐明。综上所述,MSCs外泌体作为POF治疗的新希望,作用并调控颗粒细胞从而改善卵巢功能的相关机制仍不十分清楚。本研究采用小鼠POF模型,旨在深入探究MSCs外泌体治疗POF的分子机制,为干细胞临床治疗POF提供新的理论依据和思路。研究目的本课题旨在明确骨髓MSCs改善POF小鼠卵巢功能的作用,深入研究BMSCs外泌体抑制POF小鼠卵巢颗粒细胞凋亡作用及其相关机制。研究方法1)利用密度梯度离心法分离小鼠股骨胫骨中的BMSCs。采用流式细胞术检测表面标记CD90、CD34表达,并向成骨和脂肪诱导分化进而鉴定BMSCs。2)利用聚合物沉淀法分离BMSCs来源的外泌体,利用透射电子显微镜和蛋白质印迹(Westernblot,WB)鉴定外泌体。3)通过腹腔注射顺铂构建小鼠POF模型,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清雌二醇(estradiol,E2)水平;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察卵巢组织改变。4)造模成功后第1、5、10天尾静脉注射外泌体。利用HE染色观察各组卵巢组织学改变;免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测裂解的半胱天冬酶(cleaved caspase,c-caspase)3 表达;WB 检测 p53 蛋白表达水平;ELISA 测定血清中E2的浓度。5)分离培养小鼠原代颗粒细胞后,按照处理方式不同分为五组:对照组、顺铂处理组、顺铂+外泌体组、顺铂+外泌体+核糖核酸酶(RNase)组以及顺铂+3T3-外泌体组。加入的顺铂和外泌体浓度均为10μg/mL,共培养48h后分别采用MTT法检测颗粒细胞活力,流式细胞分析检测颗粒细胞凋亡,以及WB检测凋亡相关蛋白的表达改变。6)利用生物信息学预测靶向调控p53的miRNA,筛选并验证其表达水平后选出目标miRNA。通过双荧光素酶报告基因检测(Dual-Luciferase reporter assay,DLR)验证其靶向作用。过表达颗粒细胞中目标miRNA,WB检测其凋亡抑制作用。7)敲低BMSCs中miR-664-5p后,将其外泌体与顺铂处理的颗粒细胞共培养,流式细胞分析检测颗粒细胞凋亡,WB检测p53和Bc12的表达。研究结果1)分离得到的BMSCs呈长梭形放射状排列,间充质干细胞标记物CD90阳性,造血干细胞标记物CD34阴性。BMSCs成骨向诱导分化后茜素红染色可见钙结节,成脂向诱导分化后油红O染色可见细小脂滴。2)分离得到的外泌体在透射电子显微镜下可见大小均匀、圆形或卵圆形的膜性囊泡,囊泡边缘清楚且周围有双层脂质膜。其表面标记蛋白CD63的表达明显高于BMSCs裂解液。3)POF组与对照组相比:血清E2水平下降;POF组卵巢中卵泡数量少,多为原始或初始卵泡,颗粒细胞损伤形成闭锁卵泡增多,间质增多;对照组则表现出卵泡大而丰富,卵泡液丰富,黄体多。4)与对照组相比,POF组卵巢组织结构破坏,卵泡闭锁;c-caspase3和p53蛋白表达明显上调;血清E2水平下降。与POF组相比,外泌体治疗组闭锁卵泡减少,黄体增多;c-caspase 3和p53蛋白表达下调;血清E2水平升高。5)与顺铂组相比,顺铂+外泌体组的早期颗粒细胞凋亡比例明显下降,RNase处理后凋亡比例增加。该结论与细胞活力实验一致。顺铂+外泌体组较顺铂组p53和c-caspase3蛋白表达下调,Bc12表达上调;加入RNase后p53和c-caspase3蛋白表达上调,Bc12表达下调。6)筛选并鉴定出miR-664-5p在BMSCs来源的外泌体中高度表达,且与p53的3’端非编码区(3’UTR)为相互作用位点。将miR-664-5p模拟物分别和p53野生型、突变型载体转染至颗粒细胞后,p53野生型组的相对荧光素酶活性降低。过表达颗粒细胞中的miR-664-5p后,p53蛋白表达下调。7)BMSCs中的miR-664-5p敲低后颗粒细胞凋亡的比例增加,p53蛋白表达上调,Bcl2蛋白表达下调。研究结论本研究证实了 BMSCs外泌体对POF小鼠卵巢的保护作用。揭示了 BMSCs外泌体miR-664-5p通过靶向抑制p53信号通路抑制颗粒细胞凋亡,从而改善卵巢功能,为POF的临床治疗提供了新的思路和理论支持。