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目的新生儿脑膜炎是中枢神经系统较常见的感染性疾病,在新生儿时期的大肠杆菌性脑膜炎中80%以上是由E.coli K1引起的,首先是细菌侵入血流引起菌血症,然后通过血行播散通过血脑屏障进入脑组织。血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)介于血液和脑神经细胞之间,它能够阻止大分子物质及病原体进入脑组织,起到保护的作用。构成血脑屏障的主要部分是人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelia cells,HBMEC),他们之间的连接是紧密连接。人们已经成功地从小鼠,大鼠,牛及人脑分离培养出了微血管内皮细胞。根据观察,E.coli K1对转染的HBMEC和原始的HBMEC的侵袭力无差异,可以作为试验模型而用于研究。研究者用比较功能基因组学方法,将E.coli K1株RS218和非致病性的E.coli K12株MG1655的全基因组对比分析,从中鉴定了23个大于10(?)且K12中没有的基因组岛。这些基因组岛在E.coli K1致病过程中起重要作用,我们将其称为毒力岛。ibeT是E.coli K1的毒力岛基因之一,它参与E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)进入血脑屏障内,为了探讨ibeT基因在E.coli K1侵袭人脑血管内皮细胞中的作用,本研究尝试构建并鉴定缺失毒力岛基因ibeT的侵袭性大肠杆菌E44的基因缺失株,并观察ibeT基因缺失株大肠杆菌对HBMEC的侵袭力变化,这对今后的临床治疗有重要意义。侵袭性大肠杆菌E44是从新生儿脑膜炎患者脑脊液中分离培养出的侵袭性E.coli K1突变株,具有利福平耐药性。方法1、查找基因组文库,使用Primer5软件设计引物,用PCR方法扩增出ibeT基因上游片段(A)和下游片段(B)。2、运用基因重组方法,以毒力岛基因ibeT上游片段(A)和下游片段(B)的部分序列作为同源序列的两侧序列。3、以pCVD442作为载体,构建含有相互连接的上游片段(A)和下游片段(B)的重组自杀质粒pCVD442AB。4、以野生型大肠杆菌E44为研究对象,通过接合转移和同源重组,利用氨卞抗性和利福平抗性筛选,构建缺失毒力岛基因ibeT的基因缺失株大肠杆菌。5、以不同浓度两株大肠杆菌与HBMEC共培养,计数野生型大肠杆菌和基因缺失株大肠杆菌侵入HBMEC的个数。6、用罗丹明标记的毒伞素染细胞骨架,用DAPI染细胞核,荧光显微镜观察细胞骨架的变化,同时观察两个菌株侵入HBMEC的个数。结果1、通过PCR扩增和测序分析,大肠杆菌E44的毒力岛基因ibeT缺失。2、两株细菌都能侵入到HBMEC内部。ibeT缺失株E44与野生型E44相比,侵入到HBMEC内部的个数明显下降,经过统计学分析,有显著性差异(p＜0.05)。结论1、成功构建了缺失毒力岛基因ibeT的侵袭性大肠杆菌E44的基因缺失株。2、毒力岛基因ibeT的存在,使大肠杆菌E44侵袭HBMEC的侵袭力增加。