VILL全称为VILLIN-like，绒毛蛋白样蛋白，是VILLIN蛋白超家族的成员之一。VILLIN是一种多能的肌动蛋白调节蛋白，能够依赖Ca2+成核、结合、帽化、切割上皮细胞中的肌动蛋白。在磷酸化后，通过与PIP2、PLC-γ1、Jak3相互作用来影响细胞形态和迁移等；在肿瘤癌症和抗细胞凋亡的方面有着重要的作用。VILL与VILLIN具有极为相似蛋白结构，同样具有6个重复的gelsolin-like结构域和一个headpiece(HP)结构，这预示两者具有相似的功能，但有关VILL的报道极少。与此同时，本实验室通过化学诱变获得一种呈隐性遗传的稀毛小鼠，定位鉴定为9号染色体上Vill和Plcd1两个基因的缺失，为验证(或排除)Vill基因与稀毛表型的关系，计划导入外源Vill基因来拯救突变小鼠“被毛稀疏”的表型，本文首先开展了Vill转基因小鼠工作。　　 第一部分pEF6V5His-Vill表达载体的构建。　　 构建表达Vill的表达载体是制作Vill转基因小鼠的首要工作。首先从C57BL/6小鼠肾脏中提取小鼠总RNA，通过RT-PCR方法扩增出Vill完整的编码区序列。将PCR产物与pMD19-T Vector连接，转化DH5α大肠杆菌，经蓝白斑筛选、PCR检测及测序鉴定阳性的单克隆质粒。通过引物引入SpeI和BstBI酶切位点，以及对终止密码子进行修改，再以pMD19-T-Vill为模板进行PCR扩增。将含目的基因PCR产物和pEF6V5His表达载体同时进行SpeI和BstBI的双酶切、连接、转化DH5α大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选、酶切、PCR检测和测序鉴定重组的pEF6V5His-Vill。通过电转染的方法将表达质粒pEF6V5His-Vill导入L929小鼠成纤维细胞中，使用抗His鼠单克隆抗体作为一抗，Cy3红色荧光标记的山羊抗鼠IgGH+L单克隆抗体作为二抗，经间接免疫荧光法检测pEF6/V5-His-Vill重组质粒在细胞中的表达情况。结果，我们通过RT-PCR法成功扩增出2605bp的Vill目的基因片段，构建了pMD19-T-Vill克隆载体，经进一步亚克隆，成功获得pEF6V5His-Vill重组表达载体。经体外转染细胞水平表达检测，电转染条件为80V35ms，在绿色荧光的激发下检测到L929细胞的胞质胞膜有明显的红色荧光。pEF6V5His-Vill重组表达载体在L929细胞中的成功表达，为下一步显微注射制备Vill转基因小鼠打下基础。　　 第二部分显微注射法获得Vill转基因小鼠。　　 在成功获得pEF6V5His-Vill重组表达载体的基础上，将提取的表达质粒pEF6V5His-Vill用内切酶AseI和NruI进行双酶切，经Whatman方法纯化，获得显微注射用DNA片段。从超排处理的4周龄B6CF1雌鼠输卵管中收集用于显微注射0.5天的受精卵。显微注射外源DNA后，经短暂体外培养，选择存活的胚胎过夜培养。移植进入当天见栓8周龄的ICR假孕受体小鼠输卵管，常规饲育。对出生的小鼠进行PCR检测，初步筛选阳性小鼠，计算整合效率，并观察小鼠的外观表型。结果，酶切纯化获得用于显微注射的DNA片段，该片段含有含hEF-1α启动子、Vill目的基因片段、V5、His-tag和BGH，将3ng/μl的转基因构件显微注射到390枚受精卵雄原核中，经短暂体外培养存活155枚，存活率为39.74％，最终11只受体小鼠一共出生77只小鼠，使用两种引物对这些小鼠的基因组DNA进行PCR检测，初步证实其中的17只小鼠为强阳性，2只为弱阳性，整合率为24.68％。且外观上阳性小鼠和野生型小鼠未见有明显差异，转基因阳性小鼠的检测、繁殖及深入的表型分析工作有待进一步展开。Vill转基因小鼠的获得为Vill基因的功能研究及本实验室稀毛小鼠的鉴定工作提供了很好的基础材料。