对虾白斑综合症病毒(WSSV)细胞膜受体及高分子量蛋白的初步研究

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通过蔗糖密度梯度离心从患病凡纳滨对虾头胸部组织中提取了WSSV,通过差速离心分离纯化了凡纳滨对虾鳃细胞膜。经ELISA验证,WSSV与提取的鳃细胞膜存在特异性、可饱和的结合,这符合病毒-受体结合的基本特征。可以初步判定WSSV与鳃细胞膜的结合,其实质是WSSV受体粘附蛋白与细胞膜上WSSV受体之间的结合。 SDS-PAGE以后的凡纳滨对虾鳃细胞膜转印至NC膜上,然后与地高辛标记的WSSV孵育,通过抗体和显色系统寻找能与WSSV发生结合的细胞膜蛋白。本实验中没有发现能与WSSV发生结合的细胞膜蛋白,这可能是由于SDS-PAGE和转印过程中细胞膜蛋白发生了变性,而这种变性导致了受体蛋白的失活。由此可以初步判断WSSV受体蛋白可能是一个较复杂的蛋白或者蛋白复合体。 SDS-PAGE以后的WSSV转印至NC膜上,然后与地高辛标记的凡纳滨对虾鳃细胞膜孵育,通过抗体和显色系统寻找能与细胞膜发生结合的WSSV蛋白。该实验在本实验室以前的工作中已经做过,并得到了VP37、VP39和两个高分子量蛋白四个可能的WSSV受体粘附蛋白,本文重复并验证了以前的实验。 根据已经测定的WSSV全基因序列,在WSSV的全基因序列中共有184个开放阅读框,理论上编码的蛋白分子量范围跨度非常大,从6 KD到664 KD。其中小于100 KD的有154个,100 KD到200 KD的有25个,大于200 KD的有5个。目前国内外关于WSSV结构蛋白方面的研究大都集中在100 KD以下分子量范围内。100 KD以上WSSV蛋白的相关研究国内外还没有报道。本文首次通过SDS-PAGE确认了WSSV 100 KD以上的13条结构蛋白,计算出了每条蛋白带的分子量及其在总蛋白中所占的比例。根据SDS-PAGE蛋白带的显著情况,选取了三条含量较高的蛋白带VP164、VP184和VP220,采用MALDI-TOF-MS对虾白斑综合症病毒(wssV)细胞膜受体及高分子量蛋白的初步研究测定了这三条蛋白带的氨基酸序列,通过查询数据库,确定了这三个蛋白都是由wSSV的ORF167编码,而ORF167是迄今为止病毒数据库中最大的一个ORF。这是本文的创新点,为今后WSSV的全面研究奠定了基础。
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