论文部分内容阅读
第一部分随机肽库技术筛选靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽【目的】利用细菌鞭毛随机肽库筛选靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽。【方法】利用细菌鞭毛肽库对高转移前列腺癌细胞PC-3M-1E8和不转移前列腺癌细胞PC-3M-284进行四轮正负筛选；免疫荧光法体外验证特异性与PC-3M-1E8细胞亲和的细菌克隆，获得重复性多肽序列；化学合成TMP1肽，免疫荧光法和竞争性拮抗实验验证其与不同转移潜能前列腺癌细胞和乳腺癌细胞的特异性亲和；构建荷瘤小鼠模型，体内验证TMP1肽对高转移肿瘤及其转移灶的靶向性。【结果】通过细菌鞭毛肽库对高转移前列腺癌细胞PC-3M-1E8和不转移前列腺癌细胞PC-3M-284进行四轮正负筛选，获得了若干能与高转移PC-3M-1E8细胞亲和的细菌克隆；通过免疫荧光法体外验证，筛选到一段5肽序列（ABDEF），命名为“TMP1”；免疫荧光法的体外验证再次证实，TMP1肽对高转移PC-3M-1E8细胞有很好的亲和作用，而对不转移前列腺癌PC-3M-284细胞无识别，序列随意重新排列后的错序肽对照与PC-3M-1E8细胞无亲和作用，说明TMP1肽对高转移PC-3M-1E8细胞的亲和作用是具有特异性的；竞争性拮抗实验也进一步证实了这点；此外，TMP1肽对高、中等转移潜能的乳腺癌细胞MDA-MB-435S和MDA-MB-231具有很好的亲和能力，而对于低转移潜能乳腺癌细胞MCF-7细胞无识别。TMP1肽体内实验证实，TMP1肽对源于PC-3M-1E8的高转移前列腺癌肿瘤有很好的靶向识别，而对不转移前列腺癌PC-3M-284肿瘤无识别，序列随意重新排列后的错序肽对PC-3M-1E8肿瘤无靶向作用；另外，TMP1肽对高转移潜能的MDA-MB-435S乳腺癌具有很好的靶向能力；此外，TMP1肽对肿瘤的转移灶有很好的识别能力，PC-3M-1E8肿瘤的自发肝转移灶即使直径仅有1mm，处于亚临床肿瘤状态，亦可被TMP1肽很好的靶向。【结论】通过肽库技术筛选获得的TMP1肽作为一种肿瘤及其转移灶的导向性多肽，如果偶联上显影剂或抗肿瘤药物，可以很好的用于肿瘤及其转移灶的早期诊断、早期治疗。此外，TMP1肽在肿瘤细胞膜上的受体可能为与肿瘤转移相关的抗原，该抗原还可能为一种未知蛋白。第二部分TMP1的靶向性抗肿瘤效应研究【目的】研究靶向于高转移潜能前列腺癌和乳腺癌的TMP1肽的直接抗肿瘤效应。【方法】通过免疫荧光法检测TMP1肽的细胞结合与内吞；MTT检测TMP1肽的细胞毒效应；流式细胞学方法检测TMP1肽处理后细胞的凋亡和周期阻滞；Western Bolt检测与凋亡死亡受体通路有关的caspase 8蛋白表达水平，初步探讨TMP1肽抗肿瘤效应的机制。【结果】免疫荧光实验显示TMP1肽仅结合于肿瘤细胞膜表面，即使共同孵育24小时也不会被肿瘤细胞内吞，这与以往许多报道的导向肽不同；MTT实验显示TMP1肽对肿瘤细胞有显著毒性，15μM的TMP1肽即对PC-3M-1E8细胞有显著的细胞毒效应，而且这种细胞毒性随多肽剂量的增加而增强，具有剂量依赖性，其IC50≈50μM；流式细胞学方法检测TMP1肽50或100μM处理PC-3M-1E8细胞72小时可引起显著的细胞凋亡以及G2/M期周期阻滞；Western Bolt显示TMP1肽处理后，细胞caspase 8的蛋白表达水平较处理前显著升高。【结论】TMP1肽不仅对肿瘤及其转移灶有很好的靶向效应，而且具有直接抗肿瘤作用，其作用机制可能是通过胞膜的死亡受体通路而引起细胞凋亡。TMP1肽是一种肿瘤及其转移灶的早期诊断和靶向治疗的良好载体工具。