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hERG(Human ether-a-go-go-related gene)钾通道门控过程异常会形成各种疾病,如心律失常、长QT综合征等,许多中药化合物就是通过影响hERG钾通道的门控过程来发挥其抗心律失常的作用,如槐果碱、葛根素、钩藤碱、黄连素、莲心碱等植物提取物通过抑制hERG钾离子电流,延长复极时间来治疗心室加速和室颤。所以了解hERG钾通道的门控过程的机制十分重要,有报道指出Y403位点突变为丙氨酸会影响通道的门控过程,但其作用机制不清楚。本文主要通过构建离子通道突变体、膜片钳技术等方法研究Y403位点调控hERG钾通道门控的机制。首先将Y403突变为丙氨酸进行实验研究,结果表明Y403A突变会加速通道的激活过程和去激活过程;S631A通道基本不影响通道的激活过程,会消除通道的C型失活;这一部分重复前人的实验且与前人的实验结果一致,保证了实验的一致性和可信性,另外从实验结果猜测hERG钾通道内存在N型失活,Y403位点会影响这一过程。将Y403A与具有消除C型失活作用的S631A进行双突变来探究对门控过程的影响,结果表明Y403AS631A双突变通道减慢了通道的激活过程,但加快了通道的去激活过程。有研究报道N端138-373氨基酸链能够与通道口内侧的S620T突变体相互作用来减缓通道的去激活过程,S631A与S620T功能相同(都能消除C型失活)且位置相近(都位于通道口的内侧),猜测S631A也会与N端138-373氨基酸链相互作用减缓通道的去激活过程。在Y403AS631A双突变通道的基础上分别去除N端的138-378氨基酸链、2-354氨基酸链和2-135氨基酸链进行实验,结果表明去除138-373氨基酸链会加速通道的激活过程而减缓通道的去激活过程,作为对照在野生型和S631A上也去除了 N端138-373氨基酸链,结果同样表明也会加速通道的激活过程而减缓通道的去激活过程。而去除2-354氨基酸链、2-135氨基酸链会加速通道的去激活过程。另外根据实验结果猜测hERG钾通道内可能存在N型失活,N端138-373氨基酸链会影响这一过程。N-型失活的机制为球链机制,即通道α亚基N-端的部分氨基酸(约为20个)结合在通道孔道区的内侧而导致通道失活。为了进一步探究是否存在N型失活,假设138-373长链作用的位点可能位于S6区,另外猜测Y403可能与S6结构域作用影响去激活作用。在S6结构域进行一些突变研究,实结果表明在Y403AS631A基础上将664位置的谷氨酰胺突变为丙氨酸之后,加速了通道的激活过程,减缓了Y403AS631A双突变通道的去激活过程,说明Y403能够与Q664相互作用影响通道的门控过程。根据实验猜测hERG钾通道内存在N型失活,Q664与去除N端138-373氨基酸链一样可能影响hERG钾通道的N型失活,他们可能以同一机制影响通道的门控过程。138-373长链氨基酸是“球”,664的位置可能是138-373长链结构作用的受体,两者相互作用起到一个链的作用,使138-373长链结构堵塞离子通道孔使离子通道失活。而Y403可能通过作用于S6结构域的664位置来影响N型失活。