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γ-氨基丁酸（Gamma-AminobutyricAcid，GABA）是天然存在的一种非蛋白质氨基酸，具有许多重要的生理学功能，是动植物体内主要的生物活性分子。由于乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）被认为是安全的且有较高的GABA生产能力，近年来许多研究都集中于用LAB作为细胞工厂生产GABA。本课题组前期筛选到一株高产GABA的短乳杆菌CD0817，了解该菌株的基因表达模式将有助于研究其对不同培养条件（如Mn2+胁迫）的适应性。然而，在短乳杆菌基因规范化表达研究中，对于筛选合适内参基因的研究却很少。基于此，本论文在不同胁迫条件下筛选出了合适的内参基因；此外，由于筛选内参基因的需要，本文还建立了一种新型且实用的GABA定量方法。主要结果如下。
（1）建立了一种新型且高效的GABA定量分析方法。由于谷氨酸与GABA之间存在相互作用且该作用严重阻碍了两种化合物的分离。因此，我们提出了醋酸锌辅助差异沉淀/溶解（ZA-DPD）策略，通过逐步回收GABA以除去发酵液中的干扰物谷氨酸，这主要归因于两种重要试剂（谷氨酸沉淀试剂和谷氨酸排斥试剂）的使用。在每次沉淀过程中，谷氨酸沉淀试剂保证大部分GABA仍可溶，仅少量GABA与谷氨酸共沉淀；在耦合的溶解过程中，共沉淀的GABA完全溶出，仅少量（水为溶解剂）或无（谷氨酸排斥试剂为溶解剂）谷氨酸共溶出，这一过程重复两次，直到完全去除谷氨酸盐。
随后建立了ZA-DPD—比色法定量GABA。该方法是将25μL的醋酸钠缓冲液（pH5.8）加入到已去除谷氨酸的GABA发酵液样品（2mL）中并混匀，然后加入0.2mL的茚三酮显色剂并混匀，随后放于水浴锅中50℃显色50min；之后测定吸光值，对样品中的GABA进行定量。该方法或许有助于与GABA或谷氨酸相关领域的研究。
（2）为了准确可靠的进行基因表达分析，有必要使用一个或多个合适的内参基因对基因表达数据进行标准化。本实验中，我们采用geNorm、NormFinder、BestKeeper三种统计方法，对不同培养条件、不同生长阶段的10个候选基因（FUSA[translationelongationfactorG]，16srRNA，HSP60[ChaperoninGroEL]，LDHD[D-lactatedehydrogenase]，PYRG[CTPsynthase]，RPOC[pyrroline-5-carboxylatereductase]，RECA[RecA/RadArecombinase]，PHES[Phenylalanine--tRNAligasealphasubunit]，GAPDH[Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase]，TUF[ElongationfactorTu]）的表达水平和稳定性进行评估，以筛选出合适的内参基因。结果表明，在全部样本中，最佳的内参基因为RECA，其次是TUF和PHES；在Mn2+胁迫条件下，最佳的内参基因为RECA，其次是LDHD和TUF；在谷氨酸胁迫条件下，最佳的内参基因为TUF，其次是PHES和RECA。本实验将为进一步研究CD0817等乳酸菌（LAB）在锰离子或谷氨酸条件下目的基因的表达分析进行标准化校正，同时也为其它乳酸菌内参基因的选择提供依据。
（1）建立了一种新型且高效的GABA定量分析方法。由于谷氨酸与GABA之间存在相互作用且该作用严重阻碍了两种化合物的分离。因此，我们提出了醋酸锌辅助差异沉淀/溶解（ZA-DPD）策略，通过逐步回收GABA以除去发酵液中的干扰物谷氨酸，这主要归因于两种重要试剂（谷氨酸沉淀试剂和谷氨酸排斥试剂）的使用。在每次沉淀过程中，谷氨酸沉淀试剂保证大部分GABA仍可溶，仅少量GABA与谷氨酸共沉淀；在耦合的溶解过程中，共沉淀的GABA完全溶出，仅少量（水为溶解剂）或无（谷氨酸排斥试剂为溶解剂）谷氨酸共溶出，这一过程重复两次，直到完全去除谷氨酸盐。
随后建立了ZA-DPD—比色法定量GABA。该方法是将25μL的醋酸钠缓冲液（pH5.8）加入到已去除谷氨酸的GABA发酵液样品（2mL）中并混匀，然后加入0.2mL的茚三酮显色剂并混匀，随后放于水浴锅中50℃显色50min；之后测定吸光值，对样品中的GABA进行定量。该方法或许有助于与GABA或谷氨酸相关领域的研究。
（2）为了准确可靠的进行基因表达分析，有必要使用一个或多个合适的内参基因对基因表达数据进行标准化。本实验中，我们采用geNorm、NormFinder、BestKeeper三种统计方法，对不同培养条件、不同生长阶段的10个候选基因（FUSA[translationelongationfactorG]，16srRNA，HSP60[ChaperoninGroEL]，LDHD[D-lactatedehydrogenase]，PYRG[CTPsynthase]，RPOC[pyrroline-5-carboxylatereductase]，RECA[RecA/RadArecombinase]，PHES[Phenylalanine--tRNAligasealphasubunit]，GAPDH[Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase]，TUF[ElongationfactorTu]）的表达水平和稳定性进行评估，以筛选出合适的内参基因。结果表明，在全部样本中，最佳的内参基因为RECA，其次是TUF和PHES；在Mn2+胁迫条件下，最佳的内参基因为RECA，其次是LDHD和TUF；在谷氨酸胁迫条件下，最佳的内参基因为TUF，其次是PHES和RECA。本实验将为进一步研究CD0817等乳酸菌（LAB）在锰离子或谷氨酸条件下目的基因的表达分析进行标准化校正，同时也为其它乳酸菌内参基因的选择提供依据。