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microRNA399在植物中响应磷饥饿的研究早有报道,拟南芥miR399-PHO2通路对缺磷胁迫的适应性反应的调控已被相继阐述,但番茄中的相关报道目前仍然很少,更多的研究亟待开展。据此,本研究将实验室获取的番茄高通量测序结果结合基因工程技术及生物信息学分析对番茄当中功能保守的Sly-miR399从表达模式和生理功能方面进行了较为详细的研究。揭示了Sly-miR399在番茄中的生物学功能,为磷高效作物的选育和环境保护提供了理论依据。为了了解番茄Sly-miR399受缺磷诱导的时空表达模式,研究中以水培的方式培养野生型番茄并进行完全缺磷的处理。缺磷处理后取材的时间包括6小时、12小时、1天、3天、7天,同时在缺磷7天之后再恢复供磷,此后取材时间包括供磷后6小时、12小时和1天。将处理组与对照组材料进行高通量测序并通过qRT-PCR对测序结果进行验证。结果表明:番茄与先前报道过的许多物种相似,Sly-miR399家族有多个成员,并且每个成员的前体在正义链和反义链都能分别产生一个成熟的Sly-miR399——Sly-miR399-5P、Sly-miR399-3P。根据产生的成熟Sly-miR399是否相同,本文将Sly-miR399家族的7个成员分为3组,分别命名为Sly-miR399A、Sly-miR399B、Sly-miR399C。从Sly-miR399的时间表达模式推测Sly-miR399-5P与Sly-miR399-3P成员之间存在功能冗余。根据测序的新发现,本研究构建了与Sly-miR399相关的各个表达载体用于深入了解番茄Sly-miR399的生物学功能。这些表达载体包括:Sly-miR399A启动子与GUS基因/GFP基因融合表达的载体、Sly-miR399的基因敲除或STTM沉默表达载体、Sly-miR399人工过表达载体。目前为止获得的转基因植株有promiR399A::GUS融合表达植株、pYLCas9:Sly-miR399A基因敲除植株、35S:amiR399A/B/C-5P过表达植株以及35S:STTM-Sly-miR399B/C-3P基因沉默植株。为进行Sly-miR399在番茄缺磷胁迫下的功能分析,利用本实验室保存的35S:amiR399A过表达株系以及野生型番茄同时进行不同的生理学实验。结果发现:相对于野生型,过表达Sly-miR399A会缩短番茄种子萌发的时间,而在缺磷环境中35S:amiR399A过表达株系根冠比的升高、蛋白质含量的下降有所减缓,这意味着Sly-miR399A过表达株系对于缺磷逆境的抵抗能力有所增强。过表达Sly-miR399A在正常条件下会对地上部组织中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的活性有抑制作用,在缺磷条件下则作用相反,同时35S:amiR399A株系在缺磷条件下根部苹果酸脱氢酶(MDH)的活性会受到抑制。这可能是由于在番茄中过表达Sly-miR399A会显著影响与磷吸收相关的生理指标,表明Sly-miR399A是植物中磷吸收的重要调节因子。