肝细胞癌(hepatocellular careinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，常见于亚洲和非洲国家。我国每年约有11万人死于HCC，该病严重危害着人类身体健康。由于HCC具有发病隐匿、病程短、恶性程度高、进展快、死亡率高、预后差等特点，HCC的根治主要寄望于早期发现和早期治疗。 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是胎儿血清蛋白的主要成分之一，在胚胎期表达水平较高，出生后迅速减少，一年内降为成人水平(2-20μg/L)。当肝细胞癌变时，AFP基因可被再次激活。血清AFP作为HCC较为敏感而特异的生化标志，在肝癌普查、早期诊断和疗效判定等方面发挥了重要作用，然而并不是所有HCC患者血清AFP都大于20μg/L，大约30-40﹪的HCC患者血清AFP仍然在正常值范围内。由此可见，AFP是一种生物学活性非常复杂的蛋白质，它的调控机制目前还不清楚。 1977年，Olsson等首次证明了小鼠血清AFP的表达是被raf(reguIationofalpha-fetoprotein)基因调控的，这一基因以后被重新命名为Afrl(alpha-fetoprotein regulatorl)基因。Belayew等检测了BALB/c/J小鼠肝脏AFPmRNA的表达，发现AFP mRNA的表达与血清AFP的水平一致，并且也被Afr1基因负性调控。随着转基因技术的出现，Vacher和Peyton等研究发现，Afr1是通过AFP的启动子来调控AFP基因的表达。而且，Afr1在转录和转录后水平上都参与了小鼠肝脏AFP基因的调控。2005年，Perincheri鉴定出Afrl基因就是小鼠的zHX2(zinc fingers and homeoboxes 2)基因，同时发现在血清AFP持续升高的BALB/c/J成年小鼠肝组织中ZHX2第一内含子内有逆转录病毒的插入，ZHX2基因转录异常进而表达降低。综上所述，我们可以得出以下结论：zHX2负性调控BALB/c/J成年小鼠肝组织AFP基因的表达。酵母双杂交和免疫共沉淀实验证明zHX2能与NF-YA(nuclear factor-YA)结合发挥转录抑制功能。NF-YA是NF-Y的一个亚单位，NF-Y是一个广泛存在于真核细胞的调控因子，包含三个亚单位：NF-YA、NF-YB和NF-YC。NF-YB和NF-YC相互作用形成二聚体，然后结合NF-YA形成三聚体，从而再与DNA启动子区的CCAAT box结合，调控相应基因的表达。NF-Y的三个亚单位不仅能够形成三聚体与靶基因相结合，而且可以与非DNA结合蛋白相互作用协同调节NF-Y对靶基因的调控作用。2003年，Kawata等人的研究证明ZHX2能够负性调控NF-Y下游基因cdc25C的表达。由此，我们可以推测ZHX2可以与NF-YA相互作用来负性调控NF-Y下游基因的表达。目前己知ZHX2能够负性调控成年小鼠肝组织AFP的表达，那么ZHX2在人类HCC组织中的作用如何，它是否也参与了人类AFP基因的转录调控，NF-YA是否也参与了这一调控过程呢?针对以上问题，我们设计了本实验。全文分为三章： 一、肝细胞癌中ZHX2 mRNA及蛋白表达的检测本实验检测了63例HCC及对应的癌旁非肿瘤组织中ZHX2 mRNA的表达情况，发现zHX2 mRNA的表达率在：HCC及癌旁非肿瘤组织中无显著性差异。采用组织芯片和免疫组织化学技术检测了肝组织中ZHX2蛋白的表达情况，发现在正常肝组织、肝硬化组织及癌旁非肿瘤组织中均未检测到ZHX2蛋白的表达，在HCC组织中zHX2蛋白的表达率为19.5﹪。ZHX2蛋白在Ⅲ-Ⅳ级HCC组织中的表达率为31.3﹪，明显高于Ⅰ-Ⅱ级组织中的表达率(16.5﹪)。ZHX2蛋白在发生转移的HCC组织中的表达率(24.7﹪)明显高于无转移组织中的表达率(16.8﹪)；在转移灶中的表达率(45.5﹪)也明显高于原发灶中的表达率(24.2﹪)。通过对HCC组织中ZHX2蛋白的表达情况与术前血清AFP水平进行配对比较，发现ZHX2蛋白在血清AFP正常的HCC组织中的表达率为37.9﹪，明显高于血清AFP>20μg/L组织的表达率(13.6﹪)；通过统计分析，发现ZHX2蛋白与血清AFP呈负相关关系。 二、肝细胞癌中ZHX2、NF-YA及AFP表达的相关关系采用RT-PCR检测HCC组织中ZHX2、NF-YA及AFP mRNA表达情况，发现ZHX2 mRNA在AFP mRNA阴性的25例HCC组织中的表达率为52.0﹪，明显高于AFP mRNA阳性组织中的表达率(26.3﹪)，ZHX2 mRNA与AFPmRNA表达呈负相关关系：ZHX2 mRNA在血清AFP≤20μg/L的HCC组织中的表达率为69.2﹪，明显高于血清AFP>20μg/L组织的表达率(28.0﹪)，ZHX2mRNA与血清AFP呈负相关关系；NF-YA mRNA与ZHX2 mRNA表达呈正相关关系，而与AFP mRNA表达呈负相关关系。 采用免疫组织化学方法检测HCC组织中ZHX2、NF-YA及AFP蛋白表达情况，发现ZHX2蛋白在AFP蛋白阴性的HCC组织中的表达率为23.9﹪，明显高于在AFP蛋白阳性组织中的表达率(12.8﹪)，ZHX2蛋白与AFP蛋白表达呈负相关关系；NF-YA蛋白与ZHX2蛋白表达呈正相关关系，而与AFP蛋白表达呈负相关关系。 三、应用RNA干扰检测肝癌细胞中ZHX2对AFP的调控作用为了验证HCC中ZHX2、NF-YA及AFP三者之间的调控关系，我们应用RNAi(RNA interference)沉默ZHX2基因的表达，进一步检测转染细胞中NF-YA和AFP基因的表达情况。 首先用30nM和50nM ZHX2 siRNAl转染HepG2细胞，在第24h和第48h收集转染细胞，寻找转染有效条件，结果发现50nM ZHX2 siRNA1转染HepG2细胞48h时，ZHX2 mRNA的表达水平与空白对照组相比下降的最多，达88﹪，所以ZHX2 siRNA转染的有效条件为50nM ZHX2 siRNA(包括ZHX2 siRNA1、ZHX2 siRNA2和ZHX2阴性对照siRNA)转染HepG2细胞48h。 ZHX2 siRNAl转染HepG2细胞48h后，提取RNA和蛋白检测ZHX2的表达情况，结果表明ZHX2 mRNA的表达水平低于阴性对照组，下降了88﹪，蛋白水平也下降了87﹪。在ZHX2 siRNA1成功下调ZHX2基因表达后，我们检测了NF-YA和AFP的表达情况，发现NF-YA的表达低于阴性对照组，mRNA下降了72﹪，蛋白下降了60﹪；而AFP的表达水平则表现相反的结果，AFPmRNA和蛋白表达水平分别是阴性对照组的2.6倍和2-3倍。 ZHX2 siRNA2转染HepG2细胞48h后，我们检测ZHX2 mRNA和蛋白表达情况，也发现与ZHX2 siRNAl相似的结果，但是ZHX2 siRNA2沉默效率较低；与阴性对照组相比，ZHX2 mRNA和蛋白分别下降43﹪和49﹪。同时检测ZHX2 siRNA2转染成功的细胞中NF-YA和AFP的表达情况，发现NF-YAmRNA和蛋白的表达与阴性对照组相比分别下降了48﹪和40﹪，AFP mRNA和蛋白相应上调了1.3倍和0.6倍。 综上所述，我们得出以下结论：(1)ZHX2蛋白有可能成为诊断HCC的新的标记物。(2)ZHX2蛋白可能在HCC发生发展过程中起着一定的作用，可能与HCC转移存在密切的相关关系。(3)ZHX2 mRNA和蛋白的检测可能成为血清AFP的补充应用于HCC的诊断，联合应用AFP和ZHX2抗体将提高HCC的诊断率。(4)转染ZHX2 siRNA能有效干扰ZHX2基因的表达，表明RNAi技术可以成为研究ZHX2基因功能的快速、高效的工具。(5)在人类HCC组织中ZHX2可以通过NF-YA负性调控AFP的表达。