论文部分内容阅读
MicroRNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA,在转录后水平负调控靶基因表达或抑制其翻译参与植物的各种生物学进程。miR160是一类进化上高度保守的miRNA家族,在植物生长发育过程中发挥了重要作用,但目前有关miR160在黄瓜生长发育及果实膨大中的研究报道较少。本研究在课题组前期鉴别黄瓜果实膨大基因Csa-miR160d的基础上,对黄瓜Csa-miR160s及其靶基因CsARFs家族成员进行全基因组鉴定和分析;构建Csa-miR160d过表达及短串联模拟靶标（STTM）载体转化拟南芥和黄瓜,研究Csa-miR160d的功能。本论文为揭示miR160参与植物开花及果实膨大调控的分子机制提供了科学依据。。主要研究结果如下:1.通过全基因组搜索鉴别了 4个Csa-miR160s和17个CsARFs。基因结构分析结果显示,Csa-miR160s及CsARFs的启动子序列都含有光、植物激素和胁迫响应元件。靶基因预测发现CsARF5、CsARF11、CsARF13和CsARF14为Csa-miR160s的靶基因。qRT-PCR结果显示,Csa-miR160d仅在膨大的黄瓜果实中表达,不在根、叶片和未授粉子房中表达。转录组数据和qRT-PCR结果发现,在未授粉子房与膨大果实中CsARF11与Csa-miR160d表达负相关。据此推测,Csa-miR160d可能通过负调控CsARF11表达参与了黄瓜果实膨大。2.通过蘸花法将Csa-miR160d过表达及STTM载体导入拟南芥,获得T3代转基因植株。结果发现:与野生型拟南芥（WT）相比,过表达Csa-miR160d（Csa-miR160dOE）植株呈现晚花现象,莲座叶（40d）数量显著增加,植株生长健壮,分枝数多,株型高大（60d）;而抑制Csa-miR160d表达（Csa-miR160dSTTM）植株花期明显提前,莲座叶（40 d）数量显著减少,植株生长缓慢,分枝数少,株型矮小（60 d）。这说明,Csa-miR160d能够调控拟南芥开花时间和株型。此外,过表达Csa-miR160d促进了干旱胁迫下拟南芥种子萌发,而Csa-miR160dSTTM抑制了拟南芥种子萌发。表明Csa-miR160d可能与干旱胁迫调控有关。3.将Csa-miR160d过表达及STTM载体瞬时转化开花当天黄瓜子房。结果显示,与非转基因果实（CK）相比,Csa-miR160dOE黄瓜果实中Csa-miR160d的表达量显著上调,其靶基因CsARF11的表达量显著下调,Csa-miR160dOE果实在0～5 d内快速膨大;相反,Csa-miR160dSTTM黄瓜果实中Csa-miR160d的表达量显著下调,其靶基因CsARF11的表达量显著上调,Csa-miR160dSTTM果实从4d开始出现“化瓜”。果实生理指标测定结果显示,与CK相比,Csa-miR160dOE果实中的可溶性糖和可溶性蛋白含量显著上调,而Cs-miR160dSTTM果实中可溶性糖和可溶性蛋白含量显著下调。与CK相比,Csa-miR160dOE果实中的POD和CAT活性显著上调,SOD及APX活性上调但不显著,MDA含量与CK无显著差异;Csa-miR160dSTTM果实中的CAT活性显著下调,SOD、POD、APX活性下调但不显著,MDA含量显著高于CK。Csa-miR160dOE果实与Csa-miR160dSTTM果实的SOD、POD、CAT、APX活性以及MDA含量差异显著。这些结果表明,Csa-miR160d通过抑制CsARF11基因表达、增加渗透调节物质含量和提高抗氧化物酶活性促进了黄瓜果实膨大。4.通过农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化体系获得了 Csa-miR160dOE和Csa-miR160dSTTM黄瓜转基因植株。与CK相比,Csa-miR160dOE促进了黄瓜果实膨大,而Csa-miR160dSTTM抑制了黄瓜果实膨大。种子萌发试验结果显示,Csa-miR160dOE植株种子发芽率、发芽势、主根长、侧根数等显著高于CK,而Csa-miR160dSTTM植株种子均不发芽。这表明,黄瓜Csa-miR160d促进了黄瓜种子萌发。