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目的：骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是人类最常见的关节疾病。interleukin-1β(IL-1β)既是OA滑膜分泌主要炎症因子，又是损害软骨细胞、促进关节软骨退变的重要因素。IL-1β是引起OA症状和体征的主要因素之一，是OA病理生理过程的中心环节。本文探讨了OA软骨细胞体外传代时细胞表型变化，利用青藤碱(Sinomenine，SN)和siRNA抑制IL-1β对OA软骨细胞蛋白水解酶的诱导作用，寻找治疗OA的药物和方法。
方法：⑴OA膝关节置换切除关节软骨，体外消化、分离、培养。不同代OA软骨细胞使用real-time PCR检测Ⅱ型胶原，Aggrecan mRNA表达，免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原，Aggrecan含量。⑵使用噻唑蓝(MTT)法检测药物的细胞毒作用，Western blot检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5和GADPH蛋白表达，RT-PCR检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和GADPH的mRNA含量，gelatin明胶酶谱检测培养上清液MMP-9的活性。⑶使用FAM荧光标记siRNA检测转染效率，Western blot检测IRAK-4、MMP-1、MMP-3、MMP-9和GADPH蛋白含量，或RT-PCR检测mRNA表达。⑷采用SPSS12.0软件进行统计分析，组间差异采用t检验。
结果：
⑴消化的原代(Passage0，P0)软骨细胞活细胞数＞95％。绝大部分P0软骨细胞48 h后贴壁，呈小亮点状或小圆形，未完全铺展。3日后软骨细胞呈三角形、小圆形、短梭形和不规则形。P1、P2软骨细胞生长良好，接种后约9日生长融合，较P0大，胞浆内颗粒增多，增殖良好。P3软骨细胞生长缓慢，3周无法生长融合。
⑵P0、P1和P2软骨细胞在细胞培养盖玻片培养。P0软骨细胞可见Ⅱ胶原、Aggrecan荧光信号强，P1、P2软骨细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan荧光逐渐减弱。
⑶提取P0、P1和P2软骨细胞总RNA，逆转录，real-time PCR检测不同代软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达。P0、P1和P2软骨细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达随传代增加而迅速减少。
⑷MTT检测结果显示，小于等于5 mmol/L的浓度范围内SN作用24 h，SW1353和OA软骨细胞活力正常，低浓度能刺激细胞增殖；大于5 mmol/L的浓度可见细胞活力下降明显，细胞数量减少。
⑸SW1353和OA软骨细胞在无血清培养基培养24 h后加入SN，30 min后IL-1β刺激24 h。SN可以抑制IL-1β诱导MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13mRNA表达，抑制作用呈剂量依赖性。上清中IL-1β诱导的MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白在SN的作用下也呈剂量依赖性抑制。MMP-3在细胞中含量高，IL-1β刺激后表达升高，5 mmol/L SN可明显抑制其表达。
⑹Gelatin明胶酶谱结果显示，IL-1β诱导细胞分泌MMP-9活性增加，SN作用下抑制IL-1β对SW1353和OA软骨细胞的该作用。
⑺ADAMTS是另一群软骨分解代谢因子，可以导致软骨基质中蛋白多糖等成分破坏、降解。ADAMTS-4分泌量少，ADAMTS-5表达明显，IL-1β诱导后表达增加，结果显示青藤碱以剂量依赖的方式抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5分泌。
⑻以IRAK-4(NM_016123)为模板，选取4对siRNA，长度为19bp，Blast结果排除siRNA88-106、siRNA631-649、siRNA733-751和siRNA904-922和其他编码序列/EST同源性。化学合成法合成3'端以dTdT结尾的siRNA。
⑼Lipofectamine2000转染OA软骨细胞后2 h显微镜下观察可见吞噬泡，细胞形态较转染前无明显改变，转染后6 h终止转染时，胞内吞噬泡较2 h增多。6 h后终止转染的0A软骨细生长良好。FAM标记si RNA转染后6 h见胞内绿色荧光分布。
⑽IL-1β诱导后OA软骨细胞IRAK-4 mRNA和蛋白含量较空白对照减少。4对siRNA干扰72 h，各组IRAK-4 mRNA和蛋白含量较空白对照、IL-1β组少，siRNA904-922组IRAK-4含量减少最明显。
⑾siRNA干扰48 h后给予IL-1β刺激24 h，siRNA88-106明显抑制I L-1β诱导OA软骨细胞MMP-9、MMP-13 mRNA表达；siRNA631-649明显抑制IL-1β诱导OA软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达；siRNA733-751和siRNA904-922明显抑制IL-1β诱导OA软骨细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达。
⑿FAM标记siRNA转染OA软骨细胞，6 h后更换培养液。荧光显微镜观察见胞浆内绿色荧光，荧光强度随siRNA浓度增加而增强。
⒀干扰不同时间(0，24，48，72，96，120，144，168 h)的结果显示，24 h后IRAK-4蛋白含量较0 h明显减少，48、72 h后IRAK-4表达微弱，此后IRAK-4蛋白含量逐渐增加，但168 h后仍未达空白对照水平。MMP-1，MMP-9蛋白无IL-1β刺激时表达弱，在48，72，96，120，144，168 h随着时间延长MMP-1，MMP-9蛋白表达逐渐增加。
⒁siRNA904-922(25，50，75，100 nmol/L)和不同处理作用0A软骨细胞72 h。25 nmol/L siRNA904-922干扰下，IRAK-4蛋白减少不明显，50、75、100 nmol/L时干扰效果强于25 hmol/L，阳性对照、阴性对照、Lipofectamine2000处理对IRAK-4蛋白无明显影响。MMP-3在25 nmol/LsiRNA904-922作用下稍减少。50、75、100 nmol/L siRNA904-922作用72 h后MMP-3条带减弱，三个浓度间差别不明显。
结论：①P0、P1、P2 OA软骨细胞增殖能力较好，P3细胞增殖缓慢。P0、P1、P2三代OA软骨细胞，Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA和大分子水平随传代增加而减少。②利用OA软骨细胞进行研究时，尽量用代数前的细胞，原代细胞数量少，使用扩增后的原代细胞较为可行。③SN在小于等于5 mmol/L浓度范围，24 h内未影响SW1353和OA软骨细胞活力，是应用于OA软骨细胞的安全浓度范围。④SN可抑制I L-1β诱导SW1353和OA软骨细胞多种蛋白水解酶mRNA表达或蛋白分泌，抑制作用呈剂量依赖性。⑤SN具有抑制I L-1β诱导MMP和ADAMTS表达，保护OA软骨细胞的作用。SN有可能成为新的OA治疗药物。⑥siRNA904-922对OA软骨细胞IRAK-4沉默效好，明显抑制I L-1β诱导OA关节软骨细胞多种MMP mRNA表达。⑦50 nmol/L作为siRNA904-922使用浓度，siRNA904-922抑制0A软骨细胞IRAK-4表达和IL-1β对0A软骨细胞诱导作用呈时间依赖性。⑧通过RNAi沉默IRAK-4，阻断IL-1β刺激0A软骨细胞蛋白水解酶分泌的策略可行，siRNA904-922可以较好地沉默IRAK-4，抑制IL-1β对OA软骨细胞的诱导作用，具有治疗OA的可能，值得进一步的研究。