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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，同时也是一种具有高异质性的恶性肿瘤。常见乳腺癌包括LuminalA型乳腺癌、LuminalB型乳腺癌、Her2过表达乳腺癌和三阴性乳腺癌。原发乳腺癌一般不会引起患者死亡，浸润和转移是导致乳腺癌患者死亡的直接原因。已有的研究显示上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是造成恶性肿瘤浸润、转移和耐药的起始步骤。KIBRA蛋白，(kidney and brain protein)主要在肾和脑中表达的一类蛋白，定位在细胞质中，也被称为WWC1，在Hippo-Yap信号通路中扮演至关重要的角色，主要参与记忆的形成。近年有研究表明，KIBRA可以干扰永生化乳腺癌细胞的迁移和运动，抑制乳腺癌细胞的EMT。本实验室前期结果也发现，Notch3可以通过影响Kibra调节的Hippo-Yap信号通路抑制乳腺癌EMT。也有文献报道，在急慢性淋巴细胞白血病中kibra基因启动子的甲基化与患者不良预后有关。 本课题研究中，我们首先发现在恶性行为较高的乳腺癌细胞系中Kibra表达显著降低，这一发现引起了我们极大的兴趣，我们推测在不同乳腺癌细胞Kibra表达差异可能与其甲基化程度有关。众所周知，甲基化修饰是表观遗传学的调控方式之一，基因组 DNA的甲基化修饰主要靠 DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMT）起作用，甲基化修饰的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，这些变化往往会导致基因表达谱改变，尤其是启动子区CpG岛异常高的甲基化，是导致抑癌基因沉默表达的重要原因之一。但是，单纯的CpG岛、特别是几个CpG位点的甲基化不足以抑制基因的表达。最新的研究显示，多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complex2，PRC2）家族成员EZH2，一方面可以促进组蛋白H3K27的二重和三重甲基化，另一方面通过招募DNMT1并增强其促甲基化的活性，两者共同抑制基因表达。由此可见检测肿瘤相关基因，特别是抑癌基因的CpG岛甲基化状态对于研究肿瘤的发生、发展、预后及早期诊断具有重要意义。 本课题研究中，我们首先利用免疫印迹和荧光定量PCR的方法检测了6种不同乳腺癌细胞系Kibra的蛋白和mRNA的表达水平；随后利用甲基化预测软件发现在kibra基因转录起始位点上游1000bp处存在甲基化的CpG岛；其次，我们使用DNA甲基转移酶抑制剂（RG108和5-aza-dC）竞争性抑制DNA甲基转移酶，利用免疫印迹和荧光定量PCR法检测DNA甲基转移酶抑制剂作用前后Kibra表达的变化；接下来我们设计并合成甲基化特异性的MSP引物，利用PCR法检测6中不同乳腺癌细胞甲基化的状态；随后选取ER+的MCF-7细胞和ER-的MDA-MB-231细胞作为研究对象，设计BSP引物并利用PCR、“TA”克隆、测序和甲基化分析比较了两种乳腺癌细胞系中甲基化的差异；我们也单独选用ER-的MDA-MB-231细胞作为研究对象，分析了RG108处理组和DMSO对照组kibra基因甲基化的差异；为了说明DNA甲基转移酶抑制剂作用的特异性，我们利用RG108处理联合shRNA敲减Kibra展开实验，利用免疫印迹法检测联合处理后Kibra及相关分子的蛋白表达。用CCK-8、克隆形成、划痕实验、Transwell、TUNEL等实验方法分别研究Kibra高表达和低表达对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响；通过染色质免疫共沉淀（CHIP）的方法探究了kibra基因启动子发生甲基化的分子机制；最后，我们以人体乳腺癌组织样本为研究对象，比较了三阴性乳腺癌和Luminal亚型乳腺癌组织中kibra基因甲基化的差异，利用免疫组织化学技术检测两种类型乳腺癌组织中Kibra的表达，并对结果进行统计学分析。 免疫印迹和荧光定量PCR结果显示，Kibra表达随着乳腺癌细胞恶性行为的增强而呈现下调趋势。随后我们分别使用20μM、100μM、500μM的RG108作用MDA-MB-231细胞7d，500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml的5-aza-dC作用MDA-MB-231细胞5d，免疫印迹显示随着抑制剂浓度的升高，Kibra表达呈现剂量依赖性上调，其他相关分子也呈现相应的变化。甲基化特异性的MSP引物PCR扩增结果显示在不同类型乳腺癌细胞的kibra启动子区均存在部分甲基化，当使用100μM RG108作用细胞7d，各细胞的甲基化水平明显下调或丢失。利用甲基化特异性的BSP测序引物分析显示三阴性MDA-MB-231细胞kibra基因启动子甲基化水平明显高于Luminal亚型乳腺癌细胞，RG108处理组与DMSO对照组相比，kibra基因启动子甲基化水平明显降低。单独100μM RG108处理，随着Kibra表达上调，乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，侵袭，浸润和转移能力减弱，凋亡增强；随着100μM RG108处理联合shRNA敲减Kibra，KIBRA表达下调，细胞各种功能部分被恢复，凋亡也随之减弱。CHIP实验结果显示，乳腺癌细胞中kibra基因启动子CpG岛存在DNA甲基转移酶，H3K27me3、EZH2和SUZ12的结合位点，DNA甲基转移酶调控基因组DNA甲基化，PRC2复合物调控组蛋白H3K27三甲基化，二者共同调控kibra基因甲基化，影响Kibra的表达。最后，乳腺癌组织样本显示了与细胞水平一致的研究结果，即在提取的16例乳腺癌组织标本的基因组DNA中，测序结果分析显示三阴性乳腺癌组织标本kibra基因启动子甲基化水平明显高于Luminal亚型乳腺癌组织，P<0.0001为有统计学差异；免疫组织化学结果也显示，在22例乳腺癌组织标本中，Luminal亚型乳腺癌组织Kibra表达高于三阴性乳腺癌组织。Fisher精确检验P=0.04<0.05为有统计学差异。 综上所述，本研究得出的结论有以下三点：1）随着乳腺癌恶性程度增加，Kibra的表达有部分下调或丢失；2）Kibra调控的Hippo-Yap信号通路可能与乳腺癌增生、浸润、转移和凋亡有关；3）kibra启动子上存在基因组DNA和组蛋白甲基化修饰，基因组DNA的甲基化修饰受DNA甲基转移酶调控，组蛋白H3K27三甲基化修饰受PRC2复合物特别是EZH2的调控；4）三阴性乳腺癌组织kibra基因启动子甲基化水平高于Luminal亚型乳腺癌组织。