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鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DVH)是危害雏鸭的一种急性、高致死性传染病,主要侵害3周龄以内雏鸭,已在国内广泛流行,严重威胁养鸭业的健康发展。鸭坦布苏病毒病(Duck tembusu disease)是一种传播迅速的急性传染病,可使肉鸭表现神经症状、产蛋鸭产蛋量下降等。自2010年在我国爆发以来,影响范围广,已造成巨大经济损失。目前,鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)和鸭坦布苏病毒(D uck tembusu virus,DTMUV)的抗体检测主要依赖中和试验和酶联免疫吸附试验,批量检测样品时费时费力,因此临床急需一种高效、快速的检测方法对多种病原抗体同时进行检测。VP1基因和E基因分别是鸭甲肝病毒和鸭坦布苏病毒的主要抗原基因。本试验将1型鸭甲肝病毒的VP1基因和鸭坦布苏病毒的E基因分别在BL21(DE3)大肠杆菌中表达,用纯化的重组蛋白为抗原建立1型鸭甲肝病毒与鸭坦布苏病毒的液相芯片抗体检测方法,为DHA-1和DTMU的快速血清学诊断奠定基础。本研究主要包括以下三部分内容:1.鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因序列列分析分析收集2016年山东、河南等地区发病鸭场中疑似鸭甲肝病鸭的肝脏组织,共8份,经研磨冻融离心处理后接种鸭胚,中和试验进一步确诊。结果有2株分离毒能被1型鸭甲肝病毒阳性血清中和,有6株分离毒能被3型鸭甲肝病毒阳性血清中和,初步确诊分离毒株中有2株为1型鸭甲肝病毒(DHAV-1),6株为3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)。利用设计的特异性引物对1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒分别进行RT-PCR扩增,将纯化的1型VP1基因和3型VP1基因分别克隆至pMD18-T载体中,构建pMD18-T-1VP1和pMD18-T-3VP1基因克隆重组质粒并测序,利用MegAlign软件对VP1蛋白的氨基酸同源关系进行比对,结果显示:2016年分离的1型鸭甲肝病毒毒株1-JS DH/16株和1-HZYC/16株与经典毒株1-R85952/55的同源性分别是93.8%和93.4%,与其他分离毒株的同源性为最低92%~最高94.5%;3型鸭甲肝病毒毒株3-GD/16株、3-HNSQ/16株、3-SDGT/16株、3-SDXD/16、3-SC1/16株和3-SC2/16株与经典毒株AP04114/03株的同源性分别为92.1%、92.5%、92.4%、93.5、92.4和92.4%,与其他分离株的同源性为最低90.1%~最高99.7%;利用MEGA 4.0生物学软件进行遗传进化分析,绘制进化树,可见:2016年分离毒株1-JSDH/16株和1-HZYC/16株处于同一个分支,与近几年的流行株1-CS/14株的亲缘关系最近,与经典毒株1-R85952/55株亲缘关系相对较远;3-GD/16株与3-SC1/16株、3-SC2/16株三者亲缘关系最近,处于同一个小分支上,3-SDGT/16株与3-HNSQ/16株的亲缘关系近,处于同一分支上,3-SDXD/16株单独处于一个分支,上述分离株与经典毒株3-AP04023/04株的亲缘关系较远。2.pCold-1VP1和pET-28a-E的原核表达将纯化的1VP1基因克隆至pCold-III原核表达载体中,筛选获得含1VP1基因正向插入的、有正确读码框的重组质粒p Cold-1VP1。用Nde I/Hind III进行双酶切鉴定,经琼脂糖凝胶电泳检测出两条条带,分别在4,377bp和714bp左右,与预期大小相符。提取鸭坦布苏病毒(DTMUV)的RNA,用特异性引物进行RT-PCR扩增,得到1,503bp的E基因,将纯化后的E基因克隆至pMD18-T载体中,构建pMD18-T-E重组质粒并保存,然后将其插入pET-28a(+)原核表达载体,筛选阳性重组质粒p ET-28a-E。用EcoR I/Xho I进行双酶切鉴定,经琼脂糖凝胶电泳检测出两条条带,分别在5,285bp和1,503bp左右,与预期大小相符。对获得重组表达载体p Cold-1VP1和pET-28a-E菌液,进行IPTG诱导表达,对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析(一抗分别为1型鸭甲肝病毒阳性血清和鸭坦布苏病毒阳性血清)。结果发现,DHAV-1VP1和DTMUV-E蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中可稳定、高效地表达。将表达的重组蛋白纯化后均得到单一的蛋白条带,分别为26.5kDa和54.8k Da,Western blot检测表明重组蛋白具有良好的免疫原性。3.DHAV-1和DTMUV液相芯片抗体检测方法的建立根据液相蛋白芯片技术原理,以表达的重组蛋白为抗原,分别与不同编号的微球偶联,获得偶联复合体作为捕获载体,建立了分别检测鸭血清中DHAV-1、DTMUV抗体的单一液相芯片检测方法,以及可以同时检测两种抗体的双重液相芯片检测方法,结果表明,建立的液相芯片检测方法特异性、灵敏性和可重复性良好,为DHAV-1和DTMUV抗体监测提供了高通量、重复性好、特异性高的抗体检测体系,有利于鸭甲肝病毒病和鸭坦布苏病毒病的快速检测,给生产生活带来改善,降低经济损失。