论文部分内容阅读
哺乳动物大脑新皮层主要由6层投射神经元构成,是自然界最为复杂的结构,其在切向维度上主要由四个功能区域组成:初级运动皮层（primary motor cortex,M1）、初级躯体感觉皮层（primary somatosensory cortex,S1）、初级视觉皮层（primary visual cortex,V1）和初级听觉皮层（primary auditory cortex,A1）。功能区域的形成和特化过程被称为图式形成（arealization）,图式形成缺陷与神经系统发育疾病密切相关。自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder,ASD）是一种神经发育疾病,核心特征为社交和语言障碍、刻板或重复行为。神经解剖学和影像学相关研究发现67%的ASD儿童患者的大脑额叶皮层区域面积增大。类Sotos综合征是一种过度生长疾病,临床上表现为智力障碍、语言迟缓、巨头症、先天性面部畸形以及自闭症。SETD2是催化组蛋白3第36位赖氨酸3甲基化（H3K36me3）的组蛋白甲基转移酶,在部分ASD患者和类Sotos综合征患者体内具有功能失活突变。然而,SETD2的H3K36me3甲基转移酶活性在大脑发育、社会行为以及类Sotos综合征发病中的作用与相关机制仍不清楚。由于Setd2全身性敲除小鼠在胚胎期10.5天致死,因此我们利用Cre/loxp系统构建了在大脑皮层敲除Setd2（Setd2Emx1-cKO、Setd2Nestin-cKO、Setd2Nex-cKO）的小鼠。首先,我们发现Setd2Emx1-cKO小鼠在旷场实验中探索能力下降;在三箱社会交互实验中具有显著的社会交互障碍;在水迷宫实验中表现为空间记忆和学习能力下降;在疲劳转棒实验中具有运动学习能力减弱表现。这些表型与类Sotos综合征和自闭症患者的部分表型（例如智力障碍和社交障碍）相一致。为了研究Setd2在小鼠大脑皮层图式形成中的功能,我们应用原位杂交（in situ hybridization）检测了Setd2条件性敲除小鼠大脑皮层中区域特异标志分子的表达变化。在出生后第0天（P0）的Setd2Emx1-cKO、Setd2Nestin-cKO、Setd2Nex-cKO小鼠大脑皮层中,体感区域特异的标志分子Ephrin-A5在体感皮层的表达水平显著降低;运动区域和视觉区域特异的标志分子Lmo4、Epha7在尾侧运动皮层（caudal motor cortex）的表达水平明显下降。在P0 Setd2Emx1-cKO、Setd2Nestin-cKO小鼠大脑皮层中,体感区域特异的标志分子Rorβ的表达水平在扣带回皮层显著增加。在P7 Setd2Emx1-eKO小鼠大脑中,Lmo4在体感区域第V层的表达范围明显扩大,在额叶皮层的表达明显减少;Cad8+细胞的层次分布特征消失;Rorβ的表达水平显著下降。5-HT（感觉区域特异标志分子）免疫组织化学染色结果显示,在Setd2Emx1-cKO小鼠大脑皮层中,运动区域向后侧延展,体感区域向内侧和后侧移位,视觉区域向后侧压缩,前-后侧桶状皮层（antero-lateral barrel subfield,ALBSF）几乎消失;在Setd2Nex-cKO小鼠大脑皮层中,体感区域向内侧移位,前-后侧桶状皮层几乎消失。以上结果表明Setd2对于小鼠大脑皮层图式形成的正确发生至关重要。在正常小鼠中,运动皮层和体感觉皮层的第Ⅳ层神经元分别接收来自腹外侧核（the ventral lateral nucleus,VL）和腹后侧核（the ventral posterior nucleus,VP）的丘脑-皮层轴突输入。同时,运动皮层和体感皮层的第Ⅵ层神经元也发出终止于VL和VP的皮层-丘脑轴突输出。然而在Setd2Emx1-cKO小鼠皮层中,丘脑-皮层纤维束分布在第Ⅱ-Ⅵ层;皮层-丘脑纤维束无法正常投射到对应的丘脑核团,而是混合重叠在内囊区域。这些结果说明Setd2缺失会导致小鼠皮层-丘脑-皮层环路构建过程出现异常。转录组测序（RNA-seq）结果表明,成簇原钙粘蛋白家族基因（clustered protocadherins,cPcdh）在Setd2Emx1-cKO小鼠皮层中的表达水平显著下降,而且cPcdh杂合敲除小鼠（Pcdhαβγ+/-）表现出与Setd2Emx1-cKO小鼠类似的图式形成缺陷。ChIP-seq结果表明H3K36me3修饰在Setd2Emx1-cKO小鼠皮层cPcdh的部分增强子区域明显下降,而这种修饰的改变会导致DNA从头（de novo）甲基转移酶DNMT3A/B（特别是DNMT3B）在这些增强子区域的结合增加。最后,我们构建了类Sotos综合征患者具有的SETD2点突变体（SETD2L1815W）。应用敲除SETD2的293T细胞系（293TSETD2-KO）行回复实验发现该点突变能使SETD2失去催化H3K36me3的活性。子宫电穿孔实验表明cPcdh在皮层投射神经元的表达依赖于SETD2的H3K36me3甲基转移酶功能。本研究首次系统揭示了 SETD2在大脑皮层发育中的作用,不仅为阐释表观遗传修饰在图式形成中的功能提供了直接证据,更为深入理解类Sotos综合征和自闭症的发病机理提供了强有力的分子基础和动物模型支撑。