论文部分内容阅读
该实验室过去的工作证实:低温是中华大蟾蜍卵母细胞获得成熟潜能的关键;孕酮处理后的高温卵虽无能成熟却发生了成熟过程早期阶段的变化,如孕酮刺激导致胞内cAMP浓度下降,Ca<2+>浓度上升等,但成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)未被激活;有活性的MPF注入高温卵中无法自催化扩增;孕酮刺激高温卵后,细胞质中无MPF,但注入低温卵中却能促使卵成熟.这些结果表明在中华大蟾蜍高温卵中或者MPF组分存在缺失,或者MPF自催化扩增循环中的组分存在缺失,再或者孕酮诱导MPF活化的信号通路中被阻断,而导致高温卵不具备成熟潜能.孕酮诱导卵母细胞成熟的信号通路中,c-Mos蛋白的新合成被证实是孕酮诱导卵母细胞成熟所必需,它激活MAPK并诱导一连串激酶的级联效应最终激活MPF,是位于信号通路上游的关键分子.因此该文就c-Mos在中华大蟾蜍高温卵和低温卵中的表达水平进行了分析,结果显示c-mos在两种卵中的表达没有差异,也就排除了c-Mos影响高温卵丧失成熟潜能的可能性.已知MPF由催化亚单位p34(CDK1)及调节亚单位Cyclin B组成,在经历了量的积累,两亚单位的结合,磷酸化和去磷酸化后才完全活化.CDC25是一种双特异性磷酸酶,在细胞周期过程中,它完成针对CDK1的14位Thr和15位Tyr的去磷酸化,从而使CDK1完全活化.活化后的CDK1又通过级联反应磷酸化和活化CDC25,参与MPF自催化扩增循环.因此作为MPF自扩增循环重要组分之一,有必要了解高温卵和低温卵中cdc25的表达情况.该文利用简并引物结合RACE的方法克隆到中华大蟾蜍cdc25基因全长cDNA序列并登录了GenBank,序列号为AY491052.其演绎的氨基酸序列经过blastp进行蛋白序列同源性分析后,结果表明其与已经克隆的非洲爪蟾CDC25A同源性最高,一致性高达67﹪,而与人和鼠的CDC25A也具有高于50﹪的一致性和高于60﹪的相似性,且C端功能结构域的同源性更高,因此我们将其暂定名为tcdc25A.随后运用Northern Blot的方法检测到tcdc25A在中华大蟾蜍低温卵中的转录明显高于高温卵.为了进一步了解tcdc25A在高温卵和低温卵中蛋白质水平的表达情况以及它在卵母细胞成熟中的作用,我们将其C端包括功能结构域的213个氨基酸进行了原核表达和纯化,并利用纯化的融合蛋白CTP-CDC25A-6His为抗原制备了兔源抗tCDC25A多克隆抗体,对tCDC25A在高温卵和低温卵总蛋白抽提物中的含量进行了初步分析.