论文部分内容阅读
目的：青光眼滤过性手术是目前治疗青光眼的主要手段，但术后滤过道瘢痕化往往会导致手术的失败。在眼部，CTGF是参与创伤愈合和纤维化的重要调控因子，在滤过道的纤维化过程中发挥了重要的调控作用。本实验应用RNA干扰方法抑制人胚胎眼Tenon’s囊成纤维细胞(HFTF)内CTGF的表达，以确定该方法能否抑制青光眼滤过术后滤过道的瘢痕化，从而提高手术成功率。
方法:本研究选取CTGF作为靶基因，根据RNA干扰设计原则，选取3个siRNA序列(R1/siRNA、R2/siRNA、R3/siRNA)，利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA，PCR法制备的shRNA表达盒，通过RT-PCR法、Western blot法从不同方面检测瞬时表达的siRNA对CTGF基因表达的抑制效果，筛选抑制效果最优的R3/siRNA靶位点。将R3/siRNA克隆到pEGFP质粒表达载体，同时将筛选得到R3/siRNA克隆到慢病毒表达载体，包装重组慢病毒，经PCR和酶切鉴定证明pEGFP-shCTGF重组质粒和pGCL-GFP-shCTGF重组慢病毒载体构建成功。
结果：转染入R2/siRNA、R3/siRNA位点的siRNA片断组的CTGF基因mRNA和蛋白表达水平较对照组明显减弱，R3/siRNA位点抑制能力最强，转染入R1/siRNA位点的siRNA片断检测CTGF基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组无明显差别。经酶切和测序证实pEGFP-shCTGF重组质粒和pGCL-GFP-shCTGF重组慢病毒载体构建成功。
结论：针对CTGF基因序列设计的3段siRNA表达框架，R2/siRNA、R3/siRNA位点的siRNA片断能有效地抑制CTGF基因，并能有效抑制HFTF中CTGF mRNA和蛋白的表达，为利用RNA干扰技术从转录后水平抑制青光眼滤过手术后滤过道瘢痕化的有效途径。R3/siRNA成功构建pEGFP质粒载体和慢病毒载体。