论文部分内容阅读
水稻二化螟Chilo suppressalis(Walker)是最具破坏性的水稻害虫之一,主要分布在亚洲北部,非洲和南欧,目前发生在我国南部和北部,已成为我国水稻的主要害虫,已有研究显示,小分子量热激蛋白(Small heat shock proteins,sHSPs)sHSPs是一个大的,序列、结构差异大和功能上不清楚的热休克蛋白的家族。为了深入了解sHSPs对昆虫的作用机理,克隆了6条sHSPs基因,并对其表达模式进行了研究,同时还与近缘的鳞翅目种类的sHSPs基因进行比较,从分子水平上揭示sHSPs在水稻二化螟各个生长发育阶段与温度耐受性的关系,主要研究结果如下:采用RT-PCR和RACE技术,从水稻二化螟中克隆得到6条sHSPs基因,分别为Cshsp17.2,Cshsp21.3,Cshsp22.9b,Cshsp23.9,Cshsp25.7,Cshsp27.3。6条热激蛋白基因cDNA序列全长分别为813、909、872、844、1513和1036bp,开放阅读框长度分别为447、555、621、663、714和729bp,分别编码148、184、206、220、237和242个氨基酸,等电点分别为9.69、5.97、5.79、4.50、4.55和4.94。同时这6个sHSPs都含有小分子量热休克蛋白特征的保守α-晶域。序列分析发现,这6条shsps与其它物种的shsps具有很高的相似性,并在系统进化树上被归为两类。6条shsps均不含有内含子。采用qRT-PCR技术研究了水稻二化螟6条Cshsps在高低温胁迫、不同组织和不同发育阶段条件下的表达情况。结果表明高低温胁迫都能诱导Cshsps的表达,但表达情况各不相同。Cshsp22.9b,Cshsp27.3响应高温和低温胁迫。高温可以诱导Cshsp17.2的表达,但是,它不响应低温胁迫。相反情况出现在Cshsp21.3,低温可以诱导Cshsp21.3的表达,但是它不响应高温胁迫。Cshsp25.7即不响应高温胁迫,也不响应低温胁迫。Cshsp23.9低温胁迫,表达差异显著,对于高温胁迫,表达差异温和。实时定量PCR表明Cshsp21.3,Cshsp22.9b和Cshsp27.3的mRNA表达水平在脂肪体的表达量最为丰富较其他组织(头,表皮,前肠,中肠,后肠,马氏管和血细胞)。Cshsp23.9和Cshsp25.7的最高表达量在后肠。只有Cshsp17.2在不同组织的表达水平差异温和,其他5条Cshsps表达水平差异显著。6条Cshsps在水稻二化螟各发育阶段中均能表达,其中Cshsp23.9,Cshsp25.7,Cshsp27.3在雌雄蛹的表达差异无显著差异。Cshsp25.7和Cshsp27.3,Cshsp21.3的mRNA相对表达水平在3龄幼虫体内的表达量最高,Cshsp23.9,Cshsp17.2的mRNA相对表达水平在1龄幼虫体内的表达量最高。Cshsp22.9b的最高表达水平在雄蛹。PCR法扩增了热激蛋白HSP22.9b基因的ORF,并连接至PTYB12(+)表达载体,转入Escherichia coli ER2566大肠杆菌菌株中,用不同浓度的IPTG进行了诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,目的蛋白得到了稳定的表达。