【摘 要】
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该研究以体细胞杂种F5代灌浆期种子为实验材料,提取总RNA,根据所分离的类似普通小麦13号、16号HMW-GS的N-端蛋白测序结果分别设计5′简并引物,通过RT-PCR扩增分别各得到三条
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该研究以体细胞杂种F5代灌浆期种子为实验材料,提取总RNA,根据所分离的类似普通小麦13号、16号HMW-GS的N-端蛋白测序结果分别设计5′简并引物,通过RT-PCR扩增分别各得到三条特异的cDNA片段,前者大小为:2.3kb、2.2kb和2.1kb;后者大小为2.5kb、2.2kb和2.1kb.分别将2.3kb和2.5kb大小的片段克隆到pMD18-T载体上(质粒分别命名为p13L-1和p16L-A),插入片段经PCR及限制性内切酶酶切验证后进行序列测定.利用RNA 5′端模板转换技术(SMART,the Switch Mechanism At the 5′end of RNA Transcript)合成cDNA的第一链,再经21个循环的长距离PCR(LD-PCR)合成双链cDNA,双链cDNA的范围为0.1Kb-10Kb,在2Kb处有较多的PCR产物积累.双链cDNA经SfiI(A和B)酶切、CHROMA SPIN-400层析柱除去400bp以下的小分子后与5′端脱磷的λTriplEx2载体进行连接,经体外包装,感染大肠杆菌XL1-Blue获得cDNA文库.未扩增文库文库含有1.02×106个独立的噬菌体克隆,文库的重组率为97﹪,随机挑选33个克隆进行PCR检测,克隆的cDNA片段的平均长度为823bp,丰度为1.96~106pfu/μgcDNA.取150μ1连接的重组噬菌体(约366,000个)转换成质粒表达文库.用1By13亚基抗体筛选表达文库得到1个阳性克隆.
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