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研究背景及目的脑卒中(stroke)是全世界发病率和死亡率极高的脑血管疾病,其中缺血性脑卒中(ischemic stroke)约占80%。传统的溶栓治疗使缺血脑组织得到及时再灌注的同时,也能进一步加重其病理损害,造成缺血再灌注脑损伤。近年来,越来越多研究证明固有免疫与脑缺血之间存在密切联系。位于胞浆内的模式识别受体核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)是固有免疫领域的重要分子和研究热点,其在缺血再灌注脑损伤中的作用尚未阐明。我们之前的研究已经证明,脑缺血再灌注损伤后NOD2的表达明显上调并且在小胶质细胞中有大量表达。提示小胶质细胞中NOD2介导的炎症反应参与了缺血再灌注脑损伤,但NOD2在缺血再灌注损伤进程中激活的炎症信号通路及其调控机制尚不清楚。β-arrestin 1/2是一种重要的衔接蛋白,除了使G蛋白偶联受体脱敏外,还能与多种受体相结合,调控细胞信号转导。β-arrestins1/2能直接与肿瘤坏死相关受体因子6 (Tumour-necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)结合,抑制TRAF6泛素化,负调控TLR4/IL1-R介导的炎症信号通路。现已证明TRAF6也是NOD2介导的NF-κB炎症通路中的重要因子。但是β-arrestin 1 和β-arrestin2是否调控NOD2介导的炎症信号通路及具体机制尚未见报道。本研究将应用体外培养的小胶质细胞,深入探讨NOD2活化后介导的炎症信号通路,并进一步明确β-arrestin 1/2是否通过结合TRAF6调控NOD2介导的炎症信号通路,充实完善NOD2信号通路在脑缺血再灌注炎症损伤中的作用及机制,为缺血性脑血管病的防治提供新的靶点和思路。方法1.小鼠大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)建立脑缺血模型,缺血2h之后拔线实现再灌,再灌注时间分别为2h,6h,12h,24h,48h。2.常规复苏、培养BV2小鼠小胶质细胞株至对数生长期备用。3.配置无菌特定浓度的胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide, MDP)溶液。4.采用无内毒素质粒小抽试剂盒提取β-arrestinl-flag,β-arrestin2-GFP, β-arrestin2-shRNA-GFP质粒备用。5. p-arrestinl和β-arrestin2全长质粒转染BV2细胞使β-arrestin1,β-arrestin2过表达。siRNA-β-arrestin1, shRNA-β-arrestin2转染BV2细胞使β-arrestin1,β-arrestin2基因沉默。ShRNA-NOD2转染BV2细胞使NOD2基因沉默。6.免疫沉淀法(Immunoprecipitation, IP)分别检测TRAF6与β-arrestinl, TRAF6与β-arrestin2结合情况。7.免疫印迹法(western blot)检测NOD2,β-arrestin1,β-arrestin2, TRAF6, NF-κB β-P65, IκBα, COX-2, MMP-2, MMP-9等相关蛋白的表达。8.明胶酶谱法(Gelatin zymography)测定小胶质细胞培养基中MMP-2, MMP-9的活性。9.采用GraphPad.Prism.v6.0软件检测分析实验结果,P<0.05表示有显著性差异。结果1.在野生小鼠脑缺血再灌注损伤模型中,β-arrestin1和-arrestin2蛋白表达水平明显升高,且与NOD2的蛋白表达趋势一致。2.MDP特异性激活小胶质细胞中NOD2受体。3.MDP刺激明显上调小胶质细胞中TRAF6,COX-2的表达,促进IκBa降解和NF-κB活化,并且具有时间依赖性。4.MDP刺激明显促进小胶质细胞中MMP-9的表达和活化,但对于MMP-2并没有显著性作用。5.MDP刺激小胶质细胞较短时间内即可促进β-arrestin1/2分别与TRAF6结合。6.过表达β-arrestin1/2明显抑制NOD2激活诱导的COX-2的表达和NF-κB的活化。7.基因沉默β-arrestin1/2进一步促进了NOD2激活诱导COX-2的表达以及NF-κB的活化。8.过表达β-arrestin1/2明显抑制MDP刺激小胶质细胞NOD2引起的MMP-9的活化。结论MDP特异性激活小胶质细胞NOD2明显上调TRAF6和COX-2的表达,诱导NF-κB和MMP-9活化,促进炎症反应。此外,MDP刺激可迅速促进β-arrestin1/2与TRAF6结合从而负调控NOD2介导的炎症信号通路。