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目的:肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,严重危害着人类的健康,而目前认为最重要的致癌因素之一就是癌基因与抑癌基因的突变。根据近年来研究成果得出,DKK1基因在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用,但其在肺癌中的作用尚不清楚,因此在本实验中将对DKK1基因在肺癌细胞株中的生物学作用进行初步探讨。
在本次实验中我们首先利用分子克隆技术构建DKK1的真核细胞表达载体,以此筛选建立稳定转染DKK1表达载体的肺癌细胞株,进而初步探讨DKK1对肺癌细胞株95-C迁移能力及侵袭能力的影响。
方法:
1应用分子克隆技术,构建PCMV-Tag-2b-DKK1质粒,为后续实验奠定基础。
2应用Western Blot及RT-PCR法验证Pcmv-Tag-2b-DKK1转染95C细胞后DKK1蛋白及Mrna表达水平,并以转染空载体及未转染载体的95C细胞作为阴性对照;
3应用划痕试验检测肺癌细胞株95C经转染Pcmv-Tag-2b-DKK1后,其迁移能力的改变情况,并以转染空载体及未转染载体的95C细胞作为阴性对照;
4应用Boyden Chamber法测定肺癌细胞株95C经转染pCMV-Tag-2b-DKK1后,其侵袭能力的改变情况,并以转染空载体及未转染载体的95C细胞作为阴性对照;
结果:
1应用分子克隆技术成功构建了PCMV-Tag-2b-DKK1真核表达质粒,并经酶切和DNA测序分析得到确认。
2分别应用RT-PCR和Western Blot在95C细胞株中证实了转染pCMV-Tag-2b-DKK1的细胞系成功表达了DKK1蛋白;初步建立了稳定转染95-C-Pcmv-Tag-2b-DKK1细胞株;
3在95C细胞株中分别转染pCMV-Tag-2b-DKK1及空载体,应用划痕试验检测分析发现,转染pCMV-Tag-2b-DKK148小时后的95-C细胞的抑制率分别为16％,明显低于转染PCMV-Tag-2b组和空白对照组的细胞的抑制率62%和55%(P=0.000);
4在95C细胞株中分别转染pCMV-Tag-2b-DKK1及空载体,应用Boyden小室检测分析发现,转染pCMV-Tag-2b-DKK1的细胞株侵袭穿过基底膜的平均细胞数目为85.92,明显高于转染PCMV-Tag-2b组和空白对照组的侵袭细胞数目22.52和38.37(P=0.000)。
结论:
1成功构建了pCMV-Tag-2b-DKK1真核细胞表达载体,并建立了稳定转染的95-C-pCMV-Tag-2b-DKK1细胞株,为进一步深入研究DKK1的生物学功能奠定了基础;
2 pCMV-Tag-2b-DKK1转染后使人肺癌细胞株95-C的迁移及侵袭能力增强,提示DKK1可能与肺癌的侵袭转移有关。