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猪瘟是一种传播性很强、致死率极高的热性传染病之一,它是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的,给养猪业带来了严重的危害。CSFV是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属,它的基因组编码区可编码5个结构蛋白和7个非结构蛋白。CSFV的膜囊糖蛋白E2是一种容易发生变异的蛋白,又是CSFV主要的保护性抗原蛋白,能够诱导机体产生免疫反应。猪瘟之所以广泛流行却难以彻底消灭,其分子水平上的一个重要原因是猪瘟病毒与自然界其他物种一样不断地选择进化,产生了基因多样性。本实验第一部分首先从Genbank中收集了23条CSFV的全基因组序列,对其种内的同源重组现象进行分析,找到了CSFV种内存在同源重组的证据,进而探讨了CSFV基因多样性和进化的机制;实验的第二部分也是主体部分,利用大肠杆菌原核表达系统表达了CSFV糖蛋白E2的主要抗原域,经过亲和层析将此目的蛋白纯化,然后免疫BalB小鼠获得E2糖蛋白的多克隆抗体,为进一步制备单抗提供了前提。实验内容共分为两章,具体步骤如下:1.以23株来自全世界的猪瘟病毒全基因组的编码序列为研究对象,首先利用临近偶联法(neighbor-joining)做出23条序列的系统发生树,然后通过SimPlot软件进行分析,找出哪个是疑似重组病毒以及它的两条疑似亲本链。为了进一步证实上述分析得到的结果,以疑似重组病毒CSFV39为要求序列,利用Bootscaning程序,扫描两条疑似亲本链的基因组全序列,进一步确定被提交的两条链发生了同源重组,同时计算和推断出同源重组发生的位点。研究发现CSFV39是一个重组病毒,它的两条疑似亲本链是CSFV Shimen链和GXWZ02链。2.设计两对引物,以pMC18-CSFV为模版分别进行PCR反应,扩增E2基因全长及E2基因上编码主要抗原域的一个片段(该片段长为601bp,命名为e2),将两PCR产物E2和e2以及pET28a(+)和pET32a(+)载体进行EcoRI和SalI双酶切,然后经过连接反应体系构建出两个原核表达载体:pET28a(+)-E2和pET32a(+)-e2。3.将阳性重组质粒转化表达菌BL21(DE3),在37℃条件下用1mMIPTG诱导目的蛋白表达,经SDS-PAGE分析pET32a(+)-e2重组质粒表达了分子量约42KD的目的蛋白,而pET28a-E2重组质粒没有检测到蛋白表达。4.利用His-tag亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blotting检测。融合蛋白经过尿素梯度透析并与佐剂混合用来免疫小鼠,强化免疫三周获得抗血清,将抗血清进行蛋白印迹分析。5.构建原核表达载体pGEX-4T-1-e2并表达出融合蛋白,Western blotting检测确定抗血清是针对e2目的基因产生的。