阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是目前无法治愈的人类重大疾病之一。其主要病理特征是脑部β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉积、Tau蛋白的神经原纤维缠结和神经炎症等,这些病变逐渐导致大脑神经元死亡和突触连接丢失,造成认知障碍。目前,AD的治疗策略,如针对Aβ的疗法和干细胞再生医学治疗策略,大多只能减轻AD患者症状,而无法同时实现治疗患者脑部的病理病变和重建患者脑部的神经网络,因此无法实现对AD的有效治疗。由于AD病理的高度复杂性,开发能够改善Aβ的病理聚集,同时又能再生神经元的多功能疗法对AD治疗具有重要意义。针对这一挑战,本文结合Aβ降解酶脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)基因工程化技术和促神经分化纳米载体,开发了一种多功能神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)疗法,该策略能增强神经干细胞清除Aβ的能力,提高移植的NSCs和内源性神经细胞的存活率,同时还能促进神经干细胞向神经元定向分化。并以PPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠为模型,系统研究多功能神经干细胞疗法的疗效及其机理。首先,脑部Aβ的聚集是AD的重要病理表现,有效的AD治疗方法首先要提高Aβ的清除,因此我们通过慢病毒基因工程的方法增强NSCs中NEP蛋白的表达,提高其清除Aβ的功能,为移植NSCs改善AD脑部病理奠定基础。为此,我们使用含有NEP基因的慢病毒载体质粒在293T细胞内包装出含有NEP基因的慢病毒。将含有NEP基因的慢病毒感染神经干细胞,通过流式分选的方法获得了高阳性率的NEP-NSCs细胞株。通过实时定量PCR、蛋白免疫印记和免疫荧光证明了 NEP-NSCs高表达NEP基因和NEP蛋白。体外Aβ清除实验结果证明了 NEP-NSCs具有比未经改造的NSCs更高的Aβ清除能力,并且NEP-NSCs还能够分泌携带NEP酶的细胞外囊泡实现对细胞外环境中Aβ的降解。其次,我们合成了能够同时高效递送疏水药物、造影剂和质粒基因的纳米载体PBAE-PLGA-Ag2S-RA(PPAR),用于促进神经干细胞向神经元定向分化。Wnt/β-catenin和RA信号通路是调控神经干细胞分化的关键信号通路。我们制备的PPAR纳米载体,能够递送疏水的RA,同时能够递送SOX9 siRNA表达质粒(siSOX9质粒基因)进入神经干细胞降低细胞内SOX9蛋白的表达,协同作用于Wnt/β-catenin和RA信号通路,促进神经干细胞高效地向神经元定向分化。透射电子显微镜、水合粒径和Zeta电位结果表明我们成功合成了 PPAR纳米载体,该载体具有均一的尺寸,表面带正电荷。凝胶电泳结果证明PPAR能够有效地与带负电的质粒结合。细胞标记实验结果表明PPAR能够有效地将疏水药物、造影剂和质粒基因导入神经干细胞。RT-PCR结果表明PPAR携带siSOX9质粒基因进入神经干细胞,并敲低细胞内SOX9基因的表达。进一步,神经干细胞分化实验结果表明,PPAR携带siSOX9质粒基因能够有效抑制神经干细胞向胶质细胞分化,促进神经干细胞向神经元定向分化。此外,分化后细胞的Aβ清除实验结果表明,分化后的NEP-NSCs仍然具有比分化后的NSCs更高的Aβ清除能力。因此,功能化的神经干细胞提高了 Aβ清除能力的同时还能更多地向神经元分化,有望改善Aβ的病理聚集,同时再生神经元。最后,评估了功能化神经干细胞应用于治疗AD小鼠模型的疗效。在近红外二区影像技术的指导下,将多功能神经干细胞移植治疗AD转基因小鼠模型。治疗30天和180天后,AD小鼠模型Aβ病理组织切片染色结果表明,功能神经干细胞治疗组比未治疗组对照组脑部Aβ水平显著降低。证明功能干细胞能够有效改善Aβ的病理。AD小鼠模型神经元组织切片染色结果表明,功能神经干细胞治疗组比未治疗组的神经元具有更高活性。证明移植的功能化神经干细胞有利于AD小鼠脑部的神经元再生。此外,水迷宫实验检测结果表明,功能神经干细胞治疗组的小鼠具有比未治疗组小鼠更好的记忆和认知水平。总之,动物实验结果证明,多功能的神经干细胞能够有效降低AD小鼠脑部Aβ沉积,并帮助重建神经网络,提高AD小鼠的认知水平。综上所述,本文开发了一种多功能神经干细胞的疗法,该疗法具有持续降低AD小鼠脑部Aβ沉积,再生受损的神经网络以及近红外影像指导干细胞精准移植等多重优点。这种功能化干细胞的策略有助于开发高效的AD干细胞疗法,具有潜在的临床应用前景。