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酱油质量是酱油行业发展的关键,而酱油品质主要取决于酱油风味。酱油风味的好坏与酱油发酵的酵母菌种密切相关。但是,在高盐稀态发酵后期的盐水发酵中含有17%的食盐,这种特殊的环境对微生物的生长繁殖很不利,导致细胞的存活率降低,这就要求生产中使用的酵母具有适应恶劣环境的能力。因此本实验室利用基因组重排方法对S酵母(Zygosaccharomyces. rouxii)进行基因重排,构建了耐盐菌株S3-2。目前对S酵母耐盐机制的研究尚未完全,因此本文从分子转录水平、基因序列及蛋白质结构进行比对分析及基因过量表达等方而着手,对S和S3-2的耐盐基因GPD1进行研究,为阐明S酵母的耐盐机制奠定基础。本文首先构建测序质粒pUC19-S和pUC19-S3-2,对S和S3-2的GPD1克隆测序。结果发现,相比于S菌株,S3-2的GPD1的碱基发生了突变(ATG起始密码子之前第66bp位置缺失一个碱基A;ORF中第665bp位置上的G突变成A;终止密码子TAA下游第73bp位置上增加了一个G碱基)。而后将测序结果翻译成氨基酸,预测蛋白质的二级、三级结构。分析发现,S和S3-2之间有1个氨基酸发生突变即第223位精氨酸变成赖氨酸(Arg223Lys)。继而从分子转录水平开始研究,通过半定量PCR (RT-PCR)对不同盐浓度下S和S3-2酵母GPD1RNA表达量进行分析。结果表明,S3-2GPD1表达量明显高于SGPD1。最后,构建工程菌株WYS3-2和WYS及对照菌株WY,即将构建的质粒YEp195-S、 YEp495-S3-2和YEp195转入酿酒酵母实验室菌株W303-1A中,并进行一系列指标测定,研究发现,菌株WYS3-2的耐盐性强于WYS,同时又都明显强于对照菌株WY。通过本文的研究表明：S3-2GPD1基因序列中ORF的碱基变化并未导致Gpd1p空间结构的改变,因此S3-2耐渗性高于S菌株与GPD1空间结构无关；启动子和终止子序列的碱基变化是S3-2GPD1基因转录水平提高的重要原因,进而使菌株耐渗性增强；Gpdlp是诱导甘油产生的重要酶,能够提高细胞对外界环境的应答能力。