粘细菌（Myxobacteria）是一类具有复杂多细胞社会性行为的革兰氏阴性菌,是研究生物发育的最简单的模式生物,也是一种重要的药源微生物类群。该类微生物的基因组复杂性高,基因组最大可达14.78 Mb,基因组信息分析显示水解酶类基因占到其基因组的～2.7%。糖苷水解酶在淀粉工业、食品加工及农业生产等多个行业都具有重要的应用价值。因此,挖掘粘细菌中的新糖苷水解酶对于扩展对该家族酶的认识及为工农业生产提供新的酶资源方面具有重要的意义。Corallococcus sp.EGB是本实验室分离保存的一株具有良好抗真菌能力的粘细菌,其发酵的胞外上清液具有丰富的糖苷水解酶活性。本研究以EGB菌株为材料,挖掘其基因组中具有应用研究价值的糖苷水解酶,并在分子水平、酶学性质及催化机理等方面对其进行了详细的研究。利用基因组生物信息学分析、蛋白纯化、功能验证等手段从EGB菌株中鉴定了多个葡聚糖水解酶及其基因。其中有一个新型的淀粉酶基因coMA,该基因全长1665 bp,G+C%高达69.19%,编码554个氨基酸,分子量为59.95 kDa。CoMA的N端前26个氨基酸为典型的信号肽序列。BlastP序列比对、进化树分析结果显示淀粉酶CoMA可归类于糖苷水解酶GH13家族中一个新的亚家族GH13₄3。本文构建了coMA的全长表达菌株E.coli BL21（DE3）-（pET29a（+）-coMA）,实现了 重组酶 CoMA 在E.coli BL21（DE3）中可溶性表达。经镍柱亲和层析纯化,在以可溶性淀粉为底物时比酶活力高达980 U/mg。CoMA对直链淀粉、支链淀粉、糖原、γ-环糊精、麦芽寡糖（≥G3）以及普鲁兰多糖均具有不同程度的水解作用。水解产物分析结果显示,以淀粉或麦芽三糖为底物时,水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖;以γ-环糊精为底物时,同样产生高纯度的麦芽糖;CoMA还能作用于普鲁兰多糖,产生唯一的水解产物—潘糖（panose）。以上酶学性质表明,该酶表现出高效的水解效率及独特的催化机制,使得淀粉水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖,这与已报道淀粉酶的理化性质完全不同。为了进一步阐明CoMA独特的水解特性,首先对CoMA水解淀粉过程的蓝值和旋光度进行测量,结果表明CoMA属于内切型的α-淀粉酶,有别于β-淀粉酶、外切型的产麦芽糖α-淀粉酶。随后,对CoMA水解可溶性淀粉和麦芽三糖（20 mM G3）过程中的产物进行HPLC监测。结果表明,CoMA不仅具有水解α-1,4-键的活性,还具有转糖基活性（transglycosylation activity）以及缩合活性（condensation activity）,我们推测这种多分子催化的协同作用是CoMA产高纯度麦芽糖的原因。为进一步阐明其多分子催化机制,对CoMA水解低浓度（2 mM）和高浓度（200 mM）麦芽三糖过程中的产物同样进行了监测。当CoMA水解低浓度的麦芽三糖时,整个水解过程只产生麦芽糖。表明在CoMA的转糖基活性中,转葡萄糖基活性（glucosyl-transfer activity）要高于转麦芽糖基活性（maltosyl-transfer activity）,即CoMA偏好从麦芽三糖的非还原端进行切割,同时释放麦芽糖单元并将剩下的葡萄糖单元转移给一个新的麦芽三糖形成麦芽四糖,麦芽四糖进一步被水解成2分子的麦芽糖（2G3→G2+G4→3G2）,因此整个催化过程只产生麦芽糖且无葡萄糖和其他麦芽寡糖的形成。随后的定点突变及EDC化学修饰实验表明其多分子催化活性都源于同一催化活性中心（D243-E286-D359）。基于麦芽糖淀粉酶CoMA具有利用麦芽寡糖和淀粉生产高纯度麦芽糖的特性,因此CoMA具有被应用于工业上制备高纯度麦芽糖的潜力,起着去除其他麦芽寡糖提高麦芽糖含量的作用。然而,由于CoMA在大肠杆菌中表达量较低,仅有3.3 mg/升发酵液。本文尝试了利用真核表达系统对其进行异源表达,构建表达菌株Pichia pastoris GS115（pEαA-coMA）,经甲醇诱导发酵后,表达量提高到54 mg/升培养液。重组酶性质稳定,在以淀粉为底物时,依然产生高纯度的麦芽糖。在联合本实验室一个具有良好液化能力的a-淀粉酶AmyM处理10%的淀粉时,麦芽糖的得率提高了 5倍。进而,通过基因工程手段将AmyM和CoMA这两个蛋白通过不同的连接肽进行连接,构建了三组融合蛋白。其中使用柔性连接肽（flexible linker）连接的融合蛋白（M-S2-Z）性质最优,其在酵母分泌表达量最高,达到140 mg/升发酵液。且在处理淀粉制备麦芽糖中,其麦芽糖得率最高为6%。通过基因组分析,从EGB菌株中还克隆到一个新型的β-1,3-葡聚糖酶基因lamC。该基因全长1317 bp,G+C%高达为69.8%,编码438个氨基酸,分子量为47 kDa。该酶含有一个fascin-like结构域和一个GH16催化结构域。Fascin-like结构域具有典型的β-trefoil三维结构,该结构域常出现于动物细胞的Actin结合蛋白中。Fascin-like结构域在细菌的糖苷水解酶中属于首次发现,fascin-like结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能未知。构建了表达菌株E.coli Origami B（DE3）-（pET32a（+）-lamC）,在Trx标签的作用下实现了重组酶rLamC在E.coli Origami B（DE3）中的可溶性表达。rLamC具有特殊的广底物谱活性,对β-（1,3）-葡聚糖型底物（昆布多糖、茯苓多糖、酵母葡聚糖和可得然胶）、β-（1,4）-葡聚糖型底物（羧甲基纤维素钠）、β-（1,4）-木聚糖型底物（木聚糖）和β-（1,6）-葡聚糖型底物（石耳素）都具有不同程度的水解活性。同时,rLamC对β-（1,3）/（1,6）-葡聚糖表现出外切酶活性,对β-（1,4）-木聚糖/葡聚糖则表现为内切酶活性。活性中心的定点突变（E304A和E309A）实验发现,LamC的广底物谱活性都源于同一催化活性中心。本文也首次研究了 LamC的fascin-like结构域的潜在功能。采用截短表达、酶表观动力学以及酶-多糖底物pull-down实验,证明了 LamC的fascin-like结构域是一种具有结合β-（1,3）-葡聚糖能力的新型碳水化合物结合结构域;然而fascin-like结构域不具有结合F-actin的能力。同时构建了 LamC的酵母表达菌株P.pastoris GS115（pEFαA-lamC）,经96 h发酵诱导后表达量达到160 mg/L。通过硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析将LamC从发酵液中纯化2.8倍,回收率达到48%。LamC的最适底物为昆布多糖,其相应的Km和Vmax值分别为1.4 mg/mL和12.6 μmol.min-1.mg-1。最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.0。Mn2+、DTT对LamC酶活有促进作用,Cu2+、Co2+、EDTA对酶活具有强烈的抑制作用。同时,LamC还具有水解稻瘟病菌孢子及菌丝细胞壁的能力。综上所述,从粘细菌Corallococcus sp.EGB中鉴定了两个新型的葡聚糖水解酶及其基因。其中一个为麦芽糖淀粉酶CoMA,该酶具有水解淀粉和麦芽寡糖产生高纯度的麦芽糖且产物中不含葡萄糖的显著特点;另一个是具有广底物谱活性的β-1,3-葡聚糖酶LamC,并首次证明了 LamC的fascin-like结构域是一个具有结合β-1,3-葡聚糖能力的新型碳水化合物结合域（CBM）。