论文部分内容阅读
D-氨基葡萄糖(GlcN)在人体中主要提供保护和润滑作用，由于它的多种生物活性而广泛应用在食品保健品和生物类药品中。本研究通过寻找高活性的N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(nagA)，构建工程菌，建立酶法转化生产氨基葡萄糖工艺，旨在降低成本，提高生产效率。 本研究从阪崎肠杆菌Cronobacter sakazakii中克隆到一个CsnagA，该基因由1149bp组成，编码382个氨基酸，该蛋白酶分子大小为41.3kDa。在相关NAGPase序列报道中，与来源于E.coli K-12的EcNAGPase序列相似性最高(87％)。本文通过构建工程菌pGEX-6p-CsnagA/E.coli BL21(DE3)，与来源于E.coli K-12的工程菌pGEX-6p-EcnagA/E.coli BL21(DE3)酶学性质进行分析，二者的最适反应温度和最适pH分别均为50℃和8.0。在40℃，50℃，60℃处理1h，CsNAGPase和EcNAGPase活性均保持90％以上，经过不同pH缓冲液处理后，CsNAGPase和EcNAGPase在pH5.0-9.0范围内均有超过80％的活性。Co2+对CsNAGPase的活性有很大的激活作用，而EDTA抑制CsNAGPase的活性。酶动力学分析表明:CsNAGPase的催化效率（kcat/Km）比EcNAGPase的高72.12％。而且CsNAGPase具有比EcNAGPase更好的转化率，在反应5h之后，CsNAGPase在底物浓度为4mM时有最大转化率为78.85％，而EcNAGPase在底物浓度为5mM时达到最大转化率(58.45％)，CsNAGPase的转化率比EcNAGPase高34.90％;在CsNAGPase酶促反应体系中加入终浓度为5mM Co2+时，CsNAGPase在底物浓度为1mM时转化率达到93.56％，比不加Co2+的转化率提高了18.66％。 为了改良CsNAGPase的酶学性质，利用定向进化技术对突变体进行高通量筛选，从9000多个突变体中筛选到1个酸耐受性提高的突变株1-B2。突变体1-B2经过2h的pH4.0缓冲液处理后，仍保留大约30％的活性，野生型剩余大约15％的活性;突变体1-B2经过1％乙酸处理2h后，仍有90％以上的活性，而野生型残余活性大约只有75％。通常情况下，氨基葡萄糖在碱性条件下是不稳定的，因此，该特性对在转化过程中提高氨基葡萄糖稳定性和降低乙酸的抑制作用具有实用意义。