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重楼以“蚤休”之名始载于《神农本草经》,《滇南本草》首次以重楼命名。2015版《中国药典》收载重楼为百合科云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.或七叶枝花Paris. polyphyllaSmithvar.chinensis(Franch.) Hara的干燥根茎,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于疔疮痈肿,咽喉肿痛,蛇虫咬伤,跌扑伤痛,惊风抽搐。重楼是云南白药、四川抗病毒冲剂、季德胜蛇药片、宫血宁、热毒清等著名中成药的主要原料之一,同时是云南白药牙膏、云南白药创可贴、云南白药气雾剂等大健康产品的组分之一。随着重楼工业和大健康产品的迅速发展,加上重楼资源再生周期长,从种子萌发到药用部位根茎符合药用要求,需10-15年,逐年掠夺式采挖,已使野生重楼资源枯竭。目前的解决途径主要有:规范化种植或野生抚育;扩大药源,同属植物同等入药;变废为宝,地上部分综合利用。本文的主要研究内容和结论如下: 1.重楼样品的采集和鉴定 重楼种质资源混乱,基源鉴定主要依据花期植物的地上部分,市售的样品只有根茎,不能进行准确鉴定。因此,我们在花期深入主产区进行样品的采集,经权威的重楼分类学专家进行鉴定。 样本的采集分为三部分:赴云南省、四川省、福建省、河南省等重楼的主产区进行样品的采集,并请专家进行鉴定,共采集样品73批,其中毛重楼1批,南重楼2批,滇重楼14批,华重楼52批,种子1批,华重楼地上部分3批;全国范围内收集市售样本16批;中国食品药品鉴定所购买对照药材(滇重楼)1批。 2.重楼样品中化学成分的制备 2.1.华重楼和滇重楼中呋甾皂苷、偏诺皂苷、薯蓣皂苷活性组分的制备 采用75%乙醇回流提取华重楼和滇重楼根茎各200g,大孔树脂进行粗分,H P L C用于检测不同洗脱部位重楼皂苷VII、VI、II、I、V的含量;FLASH进行快速制备,分别制备得到华重楼和滇重楼的富含呋甾皂苷、偏诺皂苷、薯蓣皂苷的六个活性组分,为深入比较不同类别成分对重楼止血作用的贡献提供样品。 2.2.华重楼主要对照品的制备 采用75%乙醇回流提取华重楼根茎和地上部分,大孔吸附树脂柱进行粗分,得30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱部位,利用紫外-可见分光光度法测定总皂苷含量,利用H P L C测定重楼皂苷VII、V I、II、I、V的含量。结果:皂苷主要富集在根茎50%和70%乙醇洗脱部位,黄酮主要集中在地上部分30%乙醇洗脱部位,利用硅胶、凝胶和制备液相制备了6个主要对照品,分别为:重楼皂苷VII、偏诺皂苷元-3-O-鼠李糖-鼠李糖-葡萄糖苷、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(l→6)-β-D吡喃葡萄糖苷和异鼠李素3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。 3.重楼样品的品质评价 3.1.重楼市售样品的质量评价 观察市售16批重楼药材外观形态上的差异;利用紫外-可见分光广度法测定总皂苷的含量;利用H P L C测定重楼皂苷VII、V I、II、I、V的皂苷含量。结果:16批样品差异显著,外观性状有原药材、饮片、粉末等形式,化学成分种类和含量上也存在较大差异,重楼皂苷VII、VI、II、I和V的总量在0%-3.980%之间,紫外测总皂苷含量在0.288%-11.1%之间,其中7批符合2015版《中国药典》重楼药材项下重楼皂苷VII、VI、II和I的总量不低于0.6%的要求。 3.2.福建不同产地华重楼的质量评价 主要通过野外实地考察,了解福建产华重楼的资源分布情况,观察野生改家种后的植株形态变化;利用H P L C测定样品中重楼皂苷VII、V I、V、II和I的含量;结果发现华重楼在福建主要分布在南平市,建阳市,龙岩市,三明市,福州市等地区;18批检测样品有10批符合2015版《中国药典》重楼药材项下重楼皂苷VII、VI、II和I的总量不低于0.6%的要求;福建省华重楼的化学成分保持高度一致性,在检测的5个指标成分中,都以偏诺皂苷类重楼皂苷VII为主;重楼野生改家种后,叶子从原来的窄叶变成宽叶,环状结节明显变粗,在化学成分上没太大变化。 3.3.基于茎痕判定的不同生长年限重楼药材中皂苷含量分析 基于茎痕数目的多少判定重楼药材的生长年限;采用HPLC测定不同样品中重楼皂苷VII、V I、V、II和I的含量。结果:不同批次重楼药材被区分为生长年限分别为3?7年、3?8年和3?9年的样品。所有检测样品均符合《中国药典》2015版重楼药材项下重楼皂苷VII、V I、II和I的总量不低于0.6%的要求;在检测的5个指标成分中,以偏诺皂苷类重楼皂苷VII为主。不同年限样品甾体皂苷的含量总体上呈现随年限增长而增加的趋势。茎痕可以作为典型外观特征纳入重楼药材传统质量评价体系。 3.4.基于UPLC-QTOF/MS和HPLC表征不同种属和地区重楼的化学组成 本实验利用UPLC-QTOF/MS对南重楼、毛重楼、云南滇重楼、四川滇重楼、四川华重楼和福建华重楼的化学成分进行鉴定,明确化学差异性;利用HPLC测定重楼皂苷VII、V I、II、I、V的皂苷含量,将定性分析的液相色谱图导入科迈恩的聚类分析软件,根据产地的不同分为五组,进行聚类。结果:共检测到100个峰,推测129个化合物,其中104个甾体皂苷,9个植物激素及糖苷,1个脂肪酸,15个含氮化合物;滇重楼和华重楼主要以17位含有羟基的呋甾,偏诺皂苷和薯蓣皂苷为主;毛重楼中化学成分最少,几乎没有皂苷;南重楼以17位不带羟基的呋甾和薯蓣皂苷为主;云南和四川的滇重楼、四川和福建的华重楼在化学成分上很相似,但是在含量存在很大差异;4种总皂苷含量:滇重楼〉华重楼〉南重楼〉毛重楼;同一地区的重楼样品聚在了一起,地域对重楼化学成分的影响大于不同变种的影响。 3.5.基于UPLC-QTOF/MS和HPLC表征华重楼不同部位的化学组成 本实验利用UPLC-QTOF/MS对不同部位中化学成分进行鉴定,明确化学差异性;利用H P L C测定重楼不同部位中重楼皂苷VII、V I、II、I、V的含量;结果:从华重楼不同部位中共检测到125个峰,推测141个化合物,其中110个甾体皂苷,5个黄酮,11个植物激素及糖苷,1个脂肪酸,14个含氮化合物;根茎、须根、种子以呋甾皂苷和偏诺皂苷为主;叶子和茎主要以黄酮和薯蓣皂苷为主;果皮主要以偏诺皂苷和薯蓣皂苷为主;4种总皂苷含量须根〉根茎〉果壳〉种子(有假种皮)>叶子〉茎〉种子(无假种皮)。