手足口病是由肠道病毒感染引起的传染病,多发于5岁以下婴幼儿,其中部分由肠道病毒71型(简称EV71)感染的患儿可引起神经系统感染症状并导致心肺功能衰竭,严重者会导致死亡。EV71病毒感染病例数量庞大,但是只有少数患者发展为重症,因此,研制EV71中和抗体,为手足口病重症患者提供特异性治疗药物,是降低手足口病发病率和死亡率的可能解决方案之一。本课题通过磁珠分选EV71感染者外周血中记忆性B细胞,在饲养层细胞中培养,加入细胞因子刺激细胞分泌抗体,用ELISA法检测细胞上清是否含有阳性抗体,提取检测结果为阳性的细胞总RNA,采用逆转录和巢式PCR方法扩增免疫球蛋白重链和轻链;经测序鉴定后,将序列克隆到真核表达载体中;通过瞬时转染293T细胞得到重组抗体,通过以上方法共分离得到59株单克隆抗体;用硫氰酸铵洗脱法检测抗体的亲和力活性,共得到6株亲和力较高的单克隆抗体;中和实验检测抗体的中和活性,成功筛选到1株抗EV71的人源中和抗体,IC50为5.5μg/m L。本课题成功建立了人源化EV71单克隆抗体的制备方法,为特异性治疗由EV71病毒感染引起的手足口病提供了新的方法和思路,同时为筛选其他人源化单克隆抗体奠定了基础。呼吸道疾病高发于春冬季,能引起呼吸道疾病的细菌和病毒多种多样,本课题建立呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、腺病毒、冠状病毒、流感病毒、EB病毒等12种呼吸道病原体实时荧光定量PCR检测方法,对北京市望京医院2011-2012年采集的178份呼吸道感染病例咽拭子样本进行检测,结果显示178份患者咽拭子样本中检测到阳性样本64例,阳性结果占总样本的36.2%。该工作为呼吸道病原体检测提供了可靠的技术手段,为呼吸道疾病预防控制提供了基础数据。